莊海峰 鄭智茵 莊曉芬 周郁鴻 沈建平

蝎毒抗癌多肽對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡及Bcl-2和p53基因表達(dá)的影響

莊海峰 鄭智茵 莊曉芬 周郁鴻 沈建平

目的研究蝎毒抗癌多肽（APBMV）在體外誘導(dǎo)人急性粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞凋亡的作用及其相關(guān)機(jī)制。 方法采用CCK-8法檢測(cè)APBMV作用后HL-60細(xì)胞的增殖抑制率，光鏡觀察APBMV作用后HL-60細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測(cè)APBMV對(duì)相關(guān)凋亡基因蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 CCK-8法顯示APBMV能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖，其對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的IC50為15．64μg/ml。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示APBMV能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。APBMV（16μg/ml）作用48h后，細(xì)胞凋亡率為（36．1±2．1）%，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。Western blot提示APBMV（4、8、12和16μg/ml)組的Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為正常對(duì)照組的78．60%、54．60%、25．50%和4．20%；p53蛋白表達(dá)量分別為正常對(duì)照組的163．00%、271．00%、355．00%和447．00%。 結(jié)論 APBMV可有效抑制HL-60細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)HL-60細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)，抑制Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān)。

蝎毒 HL-60 細(xì)胞凋亡 Bcl-2 p53

全蝎為鉗蝎科動(dòng)物鉗蝎的干燥全蟲(chóng)，中藥藥典中記載其具有清熱解毒，熄風(fēng)止痙，祛風(fēng)除濕之功效。河南醫(yī)科大學(xué)生物毒素中心利用分子篩層析技術(shù)進(jìn)一步從東亞鉗蝎粗蝎毒中分離提取出了蝎毒抗癌多肽（APBMV）[1]，實(shí)驗(yàn)證明APBMV對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[2]、前列腺癌DU145細(xì)胞[3]、卵巢癌3AO細(xì)胞[4]等腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察APBMV對(duì)人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60的增殖與凋亡的作用并探討相關(guān)機(jī)制，為蝎毒抗癌新藥的開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 HL-60細(xì)胞由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，RPMI 1640培養(yǎng)液、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司，Bcl-2鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗IgG購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司，吖啶橙（AO）為上海科興試劑公司產(chǎn)品。多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HL-60細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng) HL-60細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于20ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，并行臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)了解細(xì)胞活性。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響 稱取APBMV凍干粉5mg，加入5ml D-Hanks液，配制為1mg/ml的母液，12 000 r/min離心10min，取其上清液。使用前用D-Hanks液稀釋為4、8、12和16μg/ ml 4個(gè)濃度梯度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞，以（1～5）× 108/L的密度接種于96孔板，每孔體積200μl，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分組：（1）溶劑對(duì)照組：加入等體積D-Hanks液；（2）實(shí)驗(yàn)組：分別加入終濃度分別為4、8、12和16μg/ ml的APBMV；（3）正常對(duì)照組：不作任何處理。共培養(yǎng)48h后，每個(gè)孔內(nèi)加入10μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度OD值。分別計(jì)算細(xì)胞存活率和增殖抑制率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-溶劑對(duì)照組OD值/正常對(duì)照組OD值-溶劑對(duì)照組OD值）×100%，細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-溶劑對(duì)照組OD值）（/正常對(duì)照組OD值-溶劑對(duì)照組OD值）]×100%。

1.2.3 APBMV作用后HL-60細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 配制濃度為1mg/ml的AO母液，臨用前稀釋為10μg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞，以（1～5）×108/L密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度APBMV（4、8、12和16μg/ ml）20μl，每組各設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)48h后每孔加入AO 1μl，孵育30min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞分組同上，收集培養(yǎng)48h的HL-60細(xì)胞，洗滌離心后調(diào)整細(xì)胞密度為（1～5）×105/L，先后加入5μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶，混勻后室溫避光孵育10min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞Bcl-2及p53蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞分組同上，4、8、12、16μg/ml APBMV作用48h后，分別收集各組細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，上樣檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后掃描分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞具有增殖抑制作用，4μg/ml APBMV作用48h后，HL-60細(xì)胞活性為81.00%，增殖抑制率為19.00%；隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，當(dāng)藥物濃度為16μg/ml時(shí)，增殖抑制率為51.53%，不同濃度的APBMV組與正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制的IC50為15.64μg/ml，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響

2.2 APBMV誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下正常對(duì)照組HL-60細(xì)胞呈圓形或橢圓型，APBMV作用48h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，細(xì)胞核碎裂，染色質(zhì)凝集濃染，凋亡小體形成。實(shí)驗(yàn)組（4、8、12和16μg/ml APBMV）細(xì)胞明顯減少，不同濃度APBMV均能抑制HL-60細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，隨著APBMV濃度增高，抑制作用也增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞也相應(yīng)增多（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。APBMV作用48h后，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)活細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻的淡綠色熒光。凋亡細(xì)胞體積變小，胞核固縮、邊集或碎裂，呈現(xiàn)綠色熒光，并可見(jiàn)凋亡小體（圖2，見(jiàn)插頁(yè)）。

2.3 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響 正常對(duì)照組HL-60細(xì)胞凋亡率為（2.5±0.7）%，4、8、12和16μg/ml APBMV作用48h后，細(xì)胞凋亡率分別為（9.5±1.2）%、（15.1±2.3）%、（24.3±1.9）%和（36.1±2.1）%，不同濃度實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），說(shuō)明APBMV能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并呈濃度-效應(yīng)關(guān)系（圖3，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1不同濃度ABPMV作用后HL-60細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（A：正常對(duì)照組；B：4μg/ml組；C：8μg/ml組；D：12μg/ml組；E：16μg/ml組；×200，無(wú)染色）

圖2 熒光顯微鏡下觀察不同濃度ABPMV作用后HL-60細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（A：正常對(duì)照組；B：4μg/ml組；C：8μg/ml組；D：12μg/ml組；E：16μg/ml組；×200，AO染色）

圖3 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響（A：正常對(duì)照組；B：4μg/ml組；C：8μg/ml組；D：12μg/ml組；E：16μg/ml組）

2.4 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞Bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響 4、8、12和16μg/ml APBMV作用48h后，各實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為正常對(duì)照組的78.60%、54.60%、25.50%、4.20%；p53蛋白表達(dá)量分別為正常對(duì)照組的163.00%、271.00%、355.00%和447.00%，不同濃度APBMV組與正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見(jiàn)表2和圖4-5。

3 討論

APBMV并非單一成分的多肽，而是由4組帶有不同電荷或電量的多肽組成的混合多肽，既往研究已證實(shí)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[2-4]。本研究中CCK-8法檢測(cè)提示APBMV能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖，同時(shí)經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)APBMV能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且隨著APBMV濃度增加，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的能力也增強(qiáng)，抑制作用呈濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡是生物體基本生命活動(dòng)之一，與許多生物學(xué)過(guò)程和疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。它的作用在于清除機(jī)體損傷、衰老或多余的細(xì)胞，是維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和自身組織穩(wěn)定的重要生命現(xiàn)象。當(dāng)衰老細(xì)胞不能通過(guò)凋亡機(jī)制予以清除時(shí)，便可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[5]。Bcl-2、p53是兩個(gè)重要的細(xì)胞凋亡基因。作為凋亡抑制基因，Bcl-2可導(dǎo)致DNA受損的細(xì)胞持續(xù)存在，抑制其凋亡的發(fā)生，從而突變產(chǎn)物聚集，因此Bcl-2過(guò)度表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。p53基因是一種與人類腫瘤相關(guān)的抑癌基因[8-9]，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中不可缺少的重要基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，APBMV使HL-60細(xì)胞中抑癌基因p53蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，可能是蝎毒誘導(dǎo)細(xì)胞HL-60凋亡的分子基礎(chǔ)之一，但由于中藥制劑成分復(fù)雜，具體作用機(jī)制有待于深入研究和探索。

綜上所述，本研究提示APBMV能夠抑制HL-60增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與促使p53蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本研究結(jié)果可為蝎毒的臨床應(yīng)用提供一定的生物學(xué)依據(jù)，也可為分離、提取其中的有效抗癌成分提供一定的理論依據(jù)。進(jìn)一步的深入研究可從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：了解國(guó)內(nèi)外對(duì)于APBMV的理論研究進(jìn)展；進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)APBMV的抗腫瘤作用及其相關(guān)機(jī)制。

表2 APBMV對(duì)HL-60細(xì)胞Bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響

圖4 Western blot檢測(cè)HL-60細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)

圖5 Western blot檢測(cè)HL-60細(xì)胞p53蛋白表達(dá)

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Effect of anticancer polypeptide in scorpion venom on apoptosis and Bcl-2,p53 gene expression in human leukemia HL-60 cells

ObjectiveTo investigate the effect of antitumor polypeptide extracted from scorpion venom (APBMV)on apoptosis and Bcl-2,p53 gene expression in human leukemia HL-60 cells．Methods APBMV was separated and purified by column chromatography with SephadexG-50,and analyzed by HPLC method．The cultured HL-60 cells were treated with different concentrations of APBMV．The cell growth was assayed by CCK-8 method;the morphological changes of HL-60 cells was observe by microscope,cell apoptosis was measured by flow cytometry,the expression of Bcl-2 and p53 genes was detected by Western blot．Results CCK-8 demonstrated that APBMV restrained HL-60 cells multiplication in a dose-effect manner with a IC50of 15．64μg/ml．Flow cytometer showed that APBMV induced HL-60 cells apoptosis in a dose-effect manner;with APBMV (16μg/ml)for 48h,the apoptosis rate of HL-60 cells was(36．1±2．1)%,significantly higher than that of control group．Western blot showed that APBMV down-regulated the expression of Bcl-2 protein and up-regulated expression of p53 protein．Conclusion APBMV can effectively inhibit the proliferation and induce apoptosis of HL-60 cells,which are associated with up-regulation of p53 and down-regulation of Bcl-2 genes．

Scorpion Venom HL-60 Apoptosis Bcl-2 P53

2013-11-26）

（本文編輯：胥昀）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科

沈建平，E-mail：sjping88@163.com