姚守珍 鄭若姮 石巧鵑

不同劑量三羥異黃酮對去勢大鼠子宮質(zhì)量及內(nèi)膜的影響

姚守珍 鄭若姮 石巧鵑

目的 探討不同劑量的植物雌激素三羥異黃酮（GST）對子宮質(zhì)量及內(nèi)膜的影響。方法選取50只成熟雌性SD大鼠，隨機分為5組：假手術組、去卵巢組、去卵巢+GST低劑量組（25mg/kg）、去卵巢+GST中劑量組（50mg/kg）、去卵巢+GST高劑量組（100mg/kg），后3組每天以不同劑量GST溶液灌胃，實驗持續(xù)4周。結果實驗結束時，各組大鼠體質(zhì)量較實驗前均有增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05）,但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；GST低、中、高劑量組子宮質(zhì)量分別為（0．18±0．03）、（0．16± 0．04）、（0．17±0．05）g；對應的子宮質(zhì)量/體質(zhì)量分別為0．64±0．05、0．53±0．08、0．58±0．03，3組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；分別與去卵巢組比較[子宮質(zhì)量（0．15±0．05）g、子宮質(zhì)量/體質(zhì)量0．48±0．08]，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）；但與假手術組比較[子宮質(zhì)量（0．45±0．08）g、子宮質(zhì)量/體質(zhì)量3．45±0．25]，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．01）。顯微鏡下觀察大鼠子宮內(nèi)膜，去卵巢組子宮內(nèi)膜腺體小而稀少，使用不同劑量GST的低、中及高劑量組子宮內(nèi)膜仍與去卵巢組一樣，分布不均勻，腺體內(nèi)襯上皮由立方或扁平細胞組成，明顯富于細胞。結論不同劑量GST均不會促進去勢大鼠子宮質(zhì)量增加及子宮內(nèi)膜增生，在臨床應用可能是安全的。

植物雌激素 三羥異黃酮 子宮 子宮內(nèi)膜 安全性

絕經(jīng)綜合征指婦女絕經(jīng)前后出現(xiàn)的性激素波動或 減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀，嚴重影響絕經(jīng)婦女的身心健康和生活質(zhì)量。激素補充治療是針對絕經(jīng)相關問題而采取的一種醫(yī)療措施。三羥異黃酮（genistein，GST）是一種與雌激素作用相類似的植物雌激素類藥物，具有毒副反應較小和易從食物中獲得的優(yōu)點。本實驗旨在觀察不同劑量GST對去勢大鼠子宮質(zhì)量及子宮內(nèi)膜的影響，探討植物雌激素臨床應用的安全性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康成熟雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～280g，由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：醫(yī)動字第220010014號。所有動物在同一環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室12h明暗輪替（06∶00-18∶00），環(huán)境溫度（24±1）℃，環(huán)境濕度（60±5）%，正常進食不含大豆及豆制品標準實驗室飼料，自由飲水。

1.2 實驗藥物 GST由浙江大學泛科化工有限公司提供，純度≥98%，批號：GE20070326；二甲基亞砜由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及分組 適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機數(shù)字表進行完全隨機分組：GST低、中、高劑量組、去卵巢對照組和假手術組,每組10只。GST低、中、高劑量組及去卵巢組大鼠在10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉下，經(jīng)背側切口進行雙側卵巢切除，假手術手組大鼠手術步驟相同，但不切除卵巢。

1.3.2 給藥 術后1周開始，GST低、中、高劑量組大鼠每天以GST溶液（二甲基亞砜作為溶媒）灌胃，GST劑量分別為25、50、100mg/kg體質(zhì)量，去卵巢組和假手術組大鼠每天以等容積的二甲基亞砜灌胃。實驗持續(xù)4周。

1.4 大鼠子宮質(zhì)量測定 4周后處死大鼠，剖開腹腔，分離子宮附近的脂肪組織，將子宮剪下，用AR2130/C型電子天平準確稱取子宮質(zhì)量，計算子宮質(zhì)量（g）與體質(zhì)量（kg）的比值。

1.5 大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學檢查 大鼠子宮組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠子宮內(nèi)膜組織情況并攝片記錄。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內(nèi)實驗前后的比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 5組大鼠實驗前后體質(zhì)量比較 見表1。

圖1 5組大鼠子宮內(nèi)膜顯微鏡照片下所見（A：去卵巢對照組；B：假手術組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；HE染色，×200）

表1 5組大鼠實驗前后體質(zhì)量比較（g）

由表1可見，實驗開始時各組大鼠體質(zhì)量的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；實驗結束時，各組大鼠體質(zhì)量較實驗前均有增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2 5組大鼠子宮質(zhì)量、子宮質(zhì)量/體質(zhì)量比較 見表2。

表2 5組大鼠子宮質(zhì)量、子宮質(zhì)量/體質(zhì)量比較

由表2可見，GST低、中、高劑量組的子宮質(zhì)量及子宮質(zhì)量/體質(zhì)量分別與去卵巢對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與假手術組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；不同劑量組之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 5組大鼠子宮內(nèi)膜病理檢查所見 肉眼觀：去卵巢對照組及各實驗組大鼠子宮較假手術組明顯萎縮，而去卵巢對照組與各實驗組大鼠子宮外形則無明顯差別。顯微鏡下觀察，去卵巢對照組大鼠子宮內(nèi)膜腺體小而稀少，分布不均勻，腺體內(nèi)襯上皮由立方或扁平細胞組成，間質(zhì)纖維化，間質(zhì)細胞失去所有胞質(zhì)，導致子宮內(nèi)膜明顯富于細胞（圖1A）。假手術組子宮內(nèi)膜腺體多而豐富（圖1B）。補充不同劑量GST后，低、中及高劑量組與去卵巢對照組相似（圖1C、D、E）。

3 討論

GST是目前國際上公認的天然植物雌激素，又名金轉(zhuǎn)停、染料木素、染料木黃酮、金雀異黃酮、染料木因等，縮寫有GST、GEN、GE、GS（本文簡稱為GST），化學名為4＇，5，7-三羥基異黃酮，分子式為C15H10O5，分子量為270.24，熔點為297℃～298℃。GST常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，為黃白色粉末，紫外燈下無熒光和旋光性，無毒，味稍苦澀，難溶或不溶于水，可溶于有機溶劑及稀堿、吡啶，易溶于二甲基亞砜，pH值為7.9942，最大吸收波長為260nm，為弱酸性脂溶性藥物，是異黃酮類物質(zhì)中活性功能最強的單一成分。生殖系統(tǒng)組織細胞具有較多的雌激素受體，幾乎為其他組織的10倍，因此生殖系統(tǒng)最易受植物雌激素的影響。

雌激素能促進子宮內(nèi)膜增生變厚而導致子宮增重，并促進陰道淺表皮層細胞角化。經(jīng)典動物實驗是最早、最常用的檢測雌激素的方法，優(yōu)點是能直接檢測出受試物對活體的影響。根據(jù)這一原理,本實驗選用卵巢切除的雌性大鼠，給予不同劑量GST，觀察子宮質(zhì)量改變及子宮內(nèi)膜組織學變化，并以假手術及去卵巢大鼠作為對照物。結果不同劑量GST實驗組大鼠子宮質(zhì)量及子宮質(zhì)量/體質(zhì)量均與去卵巢對照組相似（P＞0.05），子宮均表現(xiàn)為明顯萎縮；而且不同劑量實驗組之間，子宮質(zhì)量及子宮質(zhì)量/體質(zhì)量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明GST的劑量與其對子宮及子宮內(nèi)膜的影響關系不大。因此，筆者支持不同劑量GST均無促進去卵巢大鼠子宮增大的作用。但王雯等[1]在實驗中觀察到，玉米赤霉醇（α-zearalanol，ZAL）作為植物雌激素，能使去卵巢大鼠子宮增大，但增大的程度明顯小于17β雌二醇，僅為后者的33%。其原因可能在于ZAL是一種新型植物激素玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZAN）的還原產(chǎn)物，由于植物雌激素的種類多樣，各有不同的生物活性，且作用復雜，作用機制也不同，有雙向性，其生物活性與激素的種類、劑量、療程長短、不同人種及女性本身的內(nèi)源性激素水平等因素有關。

本實驗中的子宮內(nèi)膜組織病理學觀察也均未發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠給予不同劑量GST后子宮內(nèi)膜呈增生期改變，與去卵巢對照組一樣均呈萎縮期子宮內(nèi)膜。Tempfer等[2]對關于植物雌激素不良反應的174個隨機對照試驗進行的一項Meta分析顯示，植物雌激素的補充使用可引起輕度的胃腸道不良反應；而陰道出血、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌發(fā)生率并沒有顯著增加。薛曉鷗等[3]采用對雌激素敏感的細胞株細胞培養(yǎng)方法研究雌激素活性后，認為不同濃度的GST能抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞的增殖；GST對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的細胞增殖表現(xiàn)為明顯的抑制作用，而且這一作用隨藥物濃度的增加及時間的延長而明顯加強，存在劑量和時間依賴性。這也間接驗證GST具有一定的抗腫瘤活性，為臨床上應用植物雌激素改善子宮內(nèi)膜癌的病情提供理論依據(jù)。本實驗主要模擬絕經(jīng)后婦女補充植物雌激素后子宮及子宮內(nèi)膜的變化，未發(fā)現(xiàn)植物雌激素有促子宮及子宮內(nèi)膜增生的作用，未觀察到不同劑量三羥異黃酮對子宮及子宮內(nèi)膜的抑制作用，且未發(fā)現(xiàn)有劑量及時間的相關性。有研究者報道，對絕經(jīng)后婦女補充6個月植物雌激素后復查子宮內(nèi)膜的組織學變化，19例完成研究的受試者中有1例出現(xiàn)子宮內(nèi)膜輕度增生，其余符合萎縮性的子宮內(nèi)膜變化[4]。在一項由90名絕經(jīng)后健康婦女參加的為期1年的GST臨床試驗中，GST治療組（54mg/d）對子宮內(nèi)膜的厚度有不良影響[5]。臨床研究與動物實驗結果不完全一致，可能與GST的作用主要取決于雌激素代謝狀況、局部濃度、作用組織、受體水平、靶器官或靶細胞類型有關。對高雌激素水平者，顯示抗雌激素活性；對低雌激素水平者，顯示雌激素活性。雌激素水平正常時，低濃度GST表現(xiàn)為雌激素活性，高濃度產(chǎn)生抗雌激素效應，提示在對絕經(jīng)期婦女給予激素治療時，要遵循個體化治療方案。雖然有大量的研究為植物雌激素安全運用于絕經(jīng)后婦女提供了實驗依據(jù)，但仍應注意個體對藥物的反應存在差異。

本實驗各組大鼠實驗結束時體質(zhì)量較實驗前均明顯增加（均P＜0.05），但組間的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。陳曉鋼等[6]也觀察到卵巢摘除而未予干預治療的去卵巢模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加，且植物雌激素香豆雌酚組大鼠體質(zhì)量的增加與假手術組的差異無統(tǒng)計學意義，但17β雌二醇組大鼠體質(zhì)量的增加幅度落后于假手術組與單純卵巢切除組。許建寧等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，在雌鼠妊娠期時給予GST，體重增長，但幅度小于其他組。這些研究結果均與本實驗觀察到的結果相似，但略有差異，其原因可能在于具體的干預措施或?qū)嶒瀯游锏纳L時期不同。另外GST是存在于植物中的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，并非真正意義上的雌激素，易于分解，不會在體內(nèi)蓄積，沒有外源性雌激素的不良作用，生物功能多，雖然對代謝的影響復雜，但對中老年動物幾乎無毒性。

綜上所述，不同劑量GST對子宮及子宮內(nèi)膜無明顯刺激作用，明顯優(yōu)于17β雌二醇，在臨床應用可能是安全的。GST在某些方面具有與17β雌二醇不同的藥理學特性，可能通過一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑而發(fā)揮作用，還需要進一步進行受體測定來加以驗證。

[1]王雯,楊慧,王紅霞,等．17-雌二醇及植物雌激素玉米赤霉醇致去卵巢大鼠子宮增大作用的比較[J]．首都醫(yī)科大學學報,2005,26(1):51-54．

[2]Tempfer C B,Froese G,Heinze G,et al．Side effects of phytoestrogens:a meta-analysis of randomized trials[J]．Am J Med, 2009,122(10):939-946．

[3]薛曉鷗,魏麗惠,牛建昭,等．雌激素兩種單體對子宮內(nèi)膜腺上皮細胞作用的比較[J]．中國實用婦科與產(chǎn)科雜志．2004,8(20):475-476．

[4]Nahas E A,Nahas-Neto J,Orsatti F L,et al．Efficacy and safety of a soyisoflavone extract in postmenopausal women:a randomized, double-blind and placebo-controlled study[J]．Maturitas,2007, 58(3):249-258．

[5]DAnna R,Cannata M L,Atteritano M,et al．Effects of the phytoestrogen genistein on hot flushes,endometrial,and vaginal epithelium in postmenopausal women:a 1-year randomized,doubleblind,placebo-controlled stud[J]．Menopause,2007,14(4):648-655．

[6]陳曉鋼,胡小吾,周曉清,等．香豆雌酚對去卵巢大鼠骨代謝生化指標的影響[J]．中國骨質(zhì)疏松雜志,2011,17(9):776-779．

[7]許建寧,全凱,崔濤,等．染料木素對大鼠生殖毒性的實驗研究[J]．中草藥,2004,35(11):1279-1282．

Effect of different doses of genistein on uterus and endometrium in ovariectomized rats

ObjectiveTo investigate the effect of different doses of genistein（GST）on uterus and endometrium in ovariectomized rats．MethodsForty female SD rats received ovariectomy and 10 rats received sham operation (normal control)．The ovariectomized rats were further divided into 4 groups (10 in each):rats in low-dose,middle-dose and high-dose groups were fed with 25mg/kg·d,50mg/kg·d and 100mg/kg·d GST,respectively;rats in overiectomized control group were fed with same volume of DMSO as those in normal control group．After 4 weeks,the animals were sacrificed,and uterus specimens were obtained．The ratio of weights of the uterine over body was calculated and histopathological examinations on the uterus were performed．ResultsAfter 4 weeks,body weights were increased in all groups,and there was no significant difference(P＞0．05) among 5 groups．The weights of uterus in low,middle,high GST groups and overiectomized control group were 0．18±0．03g, 0．16±0．04g,0．17±0．05g and 0．15±0．05g,respectively (P＞0．05),and the uterine/body weight ratio was 0．64±0．05,0．53± 0．08,0．58±0．03 and 0．48±0．08,respectively(P＞0．05)．There were significant differences in uterus weight and uterus/body weight ratio between GST groups and normal control group(P＜0．01)．The histopathology showed that uterus from ovariectomized group and GST groups had smaller endometrial glands than those from normal rats,and there was uneven distribution of glands and the glands were lined by cuboidal or squamous epithelial cells．ConclusionDifferent doses of GST have no significant effect on uterus enlarging and endometrial hyperplasia in ovariectomized rats,suggesting that GST administration might be safe in clinical application．

Phytoestrogen Genistein Uterus Endometrium Safety

2013-12-09）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省中醫(yī)藥管理局基金（Y026B）

310000 杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科（姚守珍）；浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院生殖科（鄭若姮）；浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心（石巧娟）

鄭若姮，E-mail：ruoruo1982@hotmail.com