張 萌，白興文，李平花，范朋舉，包慧芳，孫 普，盧曾軍，曹軼梅，劉在新

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，蘭州 730046）

口蹄疫病毒前導蛋白的分子生物學研究進展

張 萌，白興文，李平花，范朋舉，包慧芳，孫 普，盧曾軍，曹軼梅，劉在新

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，蘭州 730046）

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus ，F(xiàn)MDV）編碼的前導蛋白，不僅是一個重要的蛋白酶，而且對于病毒來說是一個重要的毒力因子，其能夠作用于宿主細胞的特異性蛋白，抵抗宿主細胞所產(chǎn)生的抗病毒效應(yīng)。本文章簡述了口蹄疫病毒前導蛋白酶的基本特性，例如前導蛋白的基因結(jié)構(gòu)與病毒復制的關(guān)系，前導蛋白酶活性的具體特點，以及前導蛋白影響病毒毒力的分子機制。

口蹄疫病毒；前導蛋白；先天性免疫

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬的一個成員，是引起口蹄疫的主要病原。該病是一種急性烈性高度傳染性疾病，主要感染豬、牛、羊等偶蹄動物[1]。FMDV分為O、A、C、Asia1、 SAT1、SAT2、SAT3七種血清型[2]，并且每種血清型有很多亞型。FMDV為單鏈正鏈RNA病毒，全長8500 nt左右，由一個長的5'端非編碼區(qū)（untranslated regions，5'UTR），一個開放閱讀框（open reading frame，ORF），一個多聚腺嘌呤核糖核酸（PloyA）尾巴組成。FMDV進入宿主細胞后，直接利用宿主細胞的翻譯機器，首先翻譯為一個長的多肽鏈，在病毒編碼的蛋白酶（Lpro、2A、3C）的作用下，加工成14種蛋白和其前體蛋白，這14種蛋白分別是10種非結(jié)構(gòu)蛋白（Lpro、2A、2B、2C、3A、3B1、3B2、3B3、3Cpro、3Dpol）和4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）組成[3]（如圖1所示）。其中非結(jié)構(gòu)蛋白基因L位于其ORF的5'端，為第一個被翻譯的基因。正是由于其是第一個被翻譯的基因，所以其在FMDV復制和毒力方面起著至關(guān)重要的作用。FMDV可以從兩個可變的起始密碼子（AUG）起始翻譯，所以有兩種形式的Lpro（Lab和Lb）；Lab從第一個AUG開始翻譯，而Lb從第二個AUG開始翻譯，一般情況下，兩個AUG相距84 nt[4]，現(xiàn)在一致認為通過核糖體掃描的方式選擇兩個不同的起始密碼子起始病毒的翻譯。細胞內(nèi)存在兩種形式的Lpro，既然功能相同，但是為什么在FMDV感染的細胞里存在兩種形式的Lpro還不是很清楚。

根據(jù)病毒血清型的不同，Lab的長度在199～202 nt[5]。兩種形式的Lpro都存在于病毒感染的細胞里，以Lb占多數(shù)[6,7]，目前來說，兩種形式的L蛋白功能是相同的。所有的病毒，能夠在宿主細胞中完成其生命周期，其一定存在某種抗細胞反應(yīng)機制，在本篇綜述里，主要介紹FMDV通過編碼的Lpro與細胞的相互作用，來完成其抗細胞防御反應(yīng)的研究進展。

圖1 口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The genome structure diagram of FMDV

1 Lpro的基因結(jié)構(gòu)與病毒復制的關(guān)系

Lpro作為非結(jié)構(gòu)蛋白，但是其基因組具有較高的易變性，尤其是兩個起始密碼子之間的區(qū)域，盡管其序列變異性較大，但是在該區(qū)域內(nèi)的RNA二級結(jié)構(gòu)相對不變[8]，推測該結(jié)構(gòu)可能參與病毒翻譯的起始；并且序列長度保守性很強，兩個起始密碼子的位置也非常保守。當兩個起始密碼子中加入一個長達57 nt的轉(zhuǎn)位子后，其毒力下降，在該嵌合突變病毒中分別插入兩個表位（HA和Flag）或者一個四個半胱氨酸基序（CCGPCC），這些突變病毒都表現(xiàn)出小的蝕斑形態(tài)，在這些嵌合病毒中，要么不表達Lab蛋白，要么Lab蛋白的表達量嚴重下降，但是這些嵌合病毒毒力下降的根本原因還不是很清楚[9]。

在構(gòu)建Lpro缺失型cDNA克隆時（如圖2所示），必須保留兩個起始密碼子及其之間的序列，病毒才能夠被拯救，這表明兩起始密碼子之間的區(qū)域可能與細胞內(nèi)調(diào)控翻譯的因子相互作用；但是只缺失兩個起始密碼子之間區(qū)域的序列，可以拯救到完整的活病毒粒子，只是其病毒的復制水平相對于未缺失的原毒有所下降。完全缺失L蛋白基因序列不能夠拯救到活的病毒粒子，但是單純?nèi)笔b區(qū)域或者兩個起始密碼子之間的序列能夠拯救到活的病毒粒子，表明L蛋白的編碼序列能夠影響病毒復制[10]，但是其影響病毒復制的分子機制還不是很清楚。

圖2 不同L蛋白缺失型感染性克隆示意圖及其在BHK-21細胞內(nèi)被拯救的情況Fig.2 Different Foot and mouth disease virus leader protein deleted infectious clone and the situation of its rescue in BHK-21

2 Lpro的蛋白酶特性

序列比對研究表明Lpro是木瓜蛋白酶樣的半胱氨酸蛋白酶，其他研究（蛋白酶抑制劑，基因工程，X-射線衍射技術(shù)）也均都證明L蛋白是一種木瓜蛋白酶樣的蛋白酶。像其他木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶一樣，Lpro也具有典型的α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)域，唯一不同的是Lpro擁有一個突出于球狀結(jié)構(gòu)的C末端（C-terminal extension，CTE）。酶活性中心由C51和H148組成的裂口組成，通過對Lpro結(jié)構(gòu)分析表明，Q146和E147可能做為底物結(jié)合位點（S1'）能夠與底物eIF4GI酶切位點的R（P1')相互作用，引起eIF4GI的切割[11]（如圖3所示）。

Lpro至少有兩種特征性活性，一種是它能夠自身從病毒編碼的多肽鏈L蛋白N端與1A蛋白C切割下來，通過順式作用或者反式作用來實現(xiàn)自身切割[12,13]；Lpro的另一種活性是其能夠切割宿主細胞中翻譯起始因子eIF4GI和eIF4GII，關(guān)閉宿主帽子依賴的翻譯，而病毒RNA存在內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES），不需要完整的eIF4G，所以病毒蛋白翻譯不受影響（如圖4所示）。Lpro切割效率在eIF4G結(jié)合eIF4E情況下，比單獨切割eIF4G時高。Lpro的表達能夠抑制宿主蛋白合成，這對于病毒抵抗細胞防御反應(yīng)是非常重要的，研究發(fā)現(xiàn)在FMDV感染的細胞內(nèi)，能夠抑制干擾素合成，從而減弱宿主細胞的抗病毒反應(yīng)[14]。

David[15]證實FMDV的Lpro能夠酶切細胞的RNA結(jié)合蛋白Gemin5，這有助于細胞的基因失活。Lpro也能夠切割真核細胞的細胞周期素，但是在FMDV感染的細胞里，Lpro切割細胞周期素對于FMDV復制是否有影響知之甚少。最近Rod rí guez Pulido[16]研究表明，在FMDV感染的細胞里，PloyA結(jié)合蛋白（PloyA binding protein，PABP）和聚嘧啶結(jié)合蛋白（Ploypyrimidine tract-binding protein，PTB）的翻譯起始因子eIF3（eIF3a和eIF3b）都能被病毒編碼的蛋白酶切割，但這個過程是否有其他蛋白參與還有待于進一步研究。

Lpro在病毒編碼的多肽鏈Q-R-K-L-K↓G-AG-Q 處實現(xiàn)自身切割，若P2位Leu變?yōu)镻he或Met，自身切割受到阻礙，而Leu變?yōu)锳la又能實現(xiàn)自身切割；在 F-A-N-L-G ↓ R-T-T-L 處切割eIF4GI，在L-L-N-V-G↓S-R-R-S處切割eIF4GII[17-19]。通過對Gemin5的分析表明，Lpro能識別（R）（R/K）（L/A）（R）基序[15]。以上僅有的幾處切割反應(yīng)表明，Lpro是一個特異性蛋白酶，但是，僅僅從這幾處切割反應(yīng)，我們不能夠確定Lpro特異性切割位點。經(jīng)過序列比對表明所有血清型Lpro第143位為Leu或者Met，Christina Mayer[20]表明第143位的Leu對底物的識別有重要作用；Lpro識別eIF4GI氨基酸殘基在645～657 aa；Lpro起催化作用的區(qū)域存在于其C端的183～195 aa；第184位的Asp和186位的Glu在所有病毒中高度保守，這兩個氨基酸的突變，影響對eIF4GI的結(jié)合和切割，而對自身切割沒有影響[21]；除此之外164位Asp突變會嚴重影響Lpro對eIF4G的酶切活性，由此表明164D對Lpro發(fā)揮蛋白酶活性至關(guān)重要[22]（關(guān)鍵性位點如圖3所示）。

3 Lpro影響病毒的毒力

利用基因工程缺失L基因的FMDV相比野生型FMDV表現(xiàn)出微弱的細胞病變反應(yīng)，缺失L基因的A12 FMDV感染牛不能夠從感染部位傳播到全身，而且更不能傳給其他動物，表明L蛋白與病毒毒力有關(guān)。

圖3 L蛋白的高級結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵性氨基酸Fig.3 The tertiary structure of leader protein and its critical amino acid

病毒與宿主細胞的相互作用是復雜的，其中，F(xiàn)MDV編碼的Lpro在抗宿主先天性免疫方面發(fā)揮著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。Lpro通過切割宿主的eIF4G，關(guān)閉宿主帽子依賴的翻譯，影響細胞因子的翻譯和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的表達，在機體產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)之前，快速利用宿主的原料合成出大量的子代病毒。

Lpro主要通過阻礙宿主細胞的先天性免疫使FMDV獲得較高的毒力。L蛋白降解宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-kB[23]，干預IRF3/7的活性[24]，影響細胞因子的轉(zhuǎn)錄，能夠顯著降低I型干擾素IFNβ[14]、III型干擾素IFNγ1[25]、趨化因子RANTES[26]的轉(zhuǎn)錄水平和表達水平（如圖4所示）。在FMDV感染的PK細胞里，IFN表達被抑制，但是在FMDV感染的pDC中，能夠分泌IFN，F(xiàn)MDV是通過什么具體途徑來抑制這些細胞因子的活性，目前來說還不是很清楚。病毒進入細胞后，通過細胞內(nèi)的RLR受體（retinoic acid-inducible gene I，RIG-1和melanoma differentiation-associated gene-5，MDA5）識別病毒的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)導，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和IRF3/7，從而引起IFN基因和RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，IFN表達后，通過自分泌或者旁分泌的方式與細胞表面的IFN受體結(jié)合，進一步引起IFN刺激基因（interferonstimulated genes，ISGs）的表達，主要是雙鏈RNA依賴的蛋白激酶，RNaseL，這些表達產(chǎn)物能夠抑制病毒的復制。而FMDV表達Lpro能夠通過抑制NF-kB和IRF3/7的活性，進而抑制ISGs的表達，使其逃逸宿主細胞的抗病毒防御反應(yīng)機制。野生型和缺失L基因的口蹄疫病毒感染沒有IFN受體的細胞，因為L蛋白能夠關(guān)閉宿主細胞的翻譯，所以說野生型病毒感染后應(yīng)該擁有更多的原料來復制，根據(jù)已有的知識來說，野生型病毒復制速度應(yīng)該快于缺失L基因的病毒，但是實驗發(fā)現(xiàn)，兩者的復制速度相當，為什么會出現(xiàn)這種情況，目前來說還不是很清楚。最近研究表明，泰勒氏病毒（Theiler's virus）能夠直接與RNase L相互作用，抑制干擾素誘導的OAS/RNase L信號通路，從而逃逸宿主細胞的先天性免疫抗病毒作用[27]。

Lpro在細胞質(zhì)中表達后，并不是在細胞中均勻分布，而是首先進入細胞核，隨后才出現(xiàn)在細胞質(zhì)中[28]。FMDV感染細胞后，能夠激活NF-kB，隨后激活的NF-kB進入細胞核，而進入細胞核的Lpro能夠降解激活的NF-kB，但是其降解機制還不明確。經(jīng)過生物信息學預測，并經(jīng)過實驗證實，Lpro存在一個保守的區(qū)域SAP（for SAF-A/B，Ainus and PIAS），其位于Lb蛋白的47 ～83 aa，在某些情況下，該結(jié)構(gòu)域與存在于細胞核中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相聯(lián)系。如果SAP區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變，病毒的毒力將會下降，因為細胞核中不出現(xiàn)Lpro，細胞核中的NF-kB也沒有被降解[29]。

4 Lpro的去泛素化活性

圖4 口蹄疫病毒與宿主細胞相關(guān)作用示意圖Fig.4 The diagram of FMDV interaction with host cell

經(jīng)過生物信息學序列比對和結(jié)構(gòu)分析表明，兩個催化殘基（Cys51 和 His148）在FMDV所有的七個血清型Lb蛋白存在兩個高度保守，F(xiàn)MDV Lpro的拓撲型與細胞內(nèi)的泛素特異性蛋白酶14（USP14），非典型性肺炎病毒（SARS-CoV）的木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain-like protease，PLpro）非常相似，這兩個酶都具有去泛素化活性。體外表達的Lpro和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的Lpro都能對細胞內(nèi)的lysine-48或者63相連的多聚泛素化鏈進行去泛素化處理。而且Lpro還能抑制細胞內(nèi)對I型IFN起激活作用的信號分子的泛素化，這些信號分子包括視磺酸誘導的基因I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）、TANK（TRAF family member associated NF-kB binding kinase）結(jié)合的激酶1（TANK binding kinase-1，TBK1）、腫瘤壞死因子受體結(jié)合的因子6和3（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF6/TRAF3）。如果突變催化活性位點（C51A 或者 D163N/D164N）或者SAP區(qū)域（I83A/L86A）將廢止其去泛素化活性或者其阻止β-IFN表達的活性[30]。

5 FMDV通過Lpro作用抗機體的適應(yīng)性免疫

體內(nèi)感染的FMDV進入初級細胞后，L蛋白通過關(guān)閉宿主帽子依賴的翻譯，抑制MHCⅠ類分子的翻譯，進而影響病毒蛋白的遞呈以及NK、NKT和CTL的識別，使感染病毒的細胞得以存活，從而給病毒復制留有空間，逃逸宿主細胞的先天性免疫[31]。

6 展望

FMDV Lpro作為一個蛋白酶，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其能夠切割宿主細胞內(nèi)個別的蛋白，能否切割其他底物還有待于進一步研究。FMDV能夠通過其編碼的L蛋白抗宿主的先天性免疫反應(yīng)，這已經(jīng)是一個不爭的事實，但是還需要借助細胞生物學等方法進一步剖析其完成抗宿主先天性免疫反應(yīng)的具體過程，這將有助于深入了解FMDV致病的分子機理，除此之外，還有助于推進免疫學、細胞生物學的研究進程。

口蹄疫作為一個危害重大的傳染病，一旦發(fā)病，能造成嚴重的經(jīng)濟損失，現(xiàn)在各國都在努力控制并且清除該病的發(fā)生。研究口蹄疫病毒的致病分子機理，尤其是研究L蛋白抗宿主免疫反應(yīng)的分子機理，有助于研究新型高效疫苗，來達到控制并且最終清除該病的目標。

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CHARACTERISTICS OF LEADER PROTEIN OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS

ZHANG Meng, BAI Xing-wen, LI Ping-hua, FAN Peng-ju, BAO Hui-fang, SUN Pu, LU Zeng-jun, CAO Yi-mei, LIU Zai-xin
(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory, Engineering Research Center of Biological Detection of Gansu Province, Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou 730046, China)

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) encodes a leader protein, which is not only an important protease but also a crucial virulence factor. The leader protein interacts with specif c proteins within host cells, leading to resist cellular defensive mechanisms. The present article summarizes characteristics of the leader protease of FMDV, for example, the relationship of its coding region with viral replication, structure, properties and molecular mechanism affecting viral virulence.

Foot-and-mouth disease virus; leader protein; innate immunity

S852.659.6

A

1674-6422（2014）01-0073-07

2013-10-14

甘肅省科技重大專項計劃項目（1102NKDA032）

張萌，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

劉在新，E-mail：Liuzaixin@caas.cn