肖 雷，孟錦昕，李 楠，高 林，何于雯，楊 恒，胡 騎，李華春，朱建波

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

·研究論文·

云南省師宗縣藍(lán)舌病病毒的分離及鑒定

肖 雷，孟錦昕，李 楠，高 林，何于雯，楊 恒，胡 騎，李華春，朱建波

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

為了解近年來云南省師宗縣藍(lán)舌病病毒流行情況，2012年在師宗縣五龍鄉(xiāng)建立了10頭藍(lán)舌病血清學(xué)陰性黃牛的監(jiān)控動物群。從2012年5～10月，每周采血1次，11～12月，每月采血1次，采用C-ELISA進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測。8月開始動物血清學(xué)檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陽性，至11月，監(jiān)控動物全部轉(zhuǎn)為陽性。用轉(zhuǎn)陽前1周、轉(zhuǎn)陽本周、轉(zhuǎn)陽后2～13周的經(jīng)處理的紅細(xì)胞靜脈接種雞胚，收獲雞胚肝臟，用PBS懸浮搗碎的雞胚肝臟，上清接種于C6/36細(xì)胞一代、BHK-21三代后，出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathic effect, CPE）。采用RT-PCR方法，針對藍(lán)舌病較為保守的血清型群特異片段VP7設(shè)計(jì)了2對引物，擴(kuò)增其相應(yīng)片段。結(jié)果顯示，共分離到86份疑似分離物，其中67份疑似分離物細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出1156 bp片段，初步確認(rèn)為藍(lán)舌病病毒。采用國際24個(gè)藍(lán)舌病標(biāo)準(zhǔn)毒及24個(gè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對86份疑似分離物及其對應(yīng)血清進(jìn)行細(xì)胞微量中和試驗(yàn)，67份毒株為藍(lán)舌病病毒，與RT-PCR結(jié)果一致。通過對2份經(jīng)中和試驗(yàn)定型為BTV-1、BTV-16分離株的VP2基因測序分析發(fā)現(xiàn)，BTV-1株序列與同型Y863（登錄號：KC879616）參考毒株的同源性為92%，BTV-16株序列與登錄號為AB686221的毒株同源性為99%。結(jié)果表明共分離到67株藍(lán)舌病毒株，分離株主要為BTV-1、BTV-9、BTV-16三個(gè)血清型。

藍(lán)舌病病毒；分離；鑒定

藍(lán)舌病（bluetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）通過吸血昆蟲-庫蠓叮咬傳播，感染牛羊等反芻動物的一種非接觸性傳染病，全球已知至少有24個(gè)不同血清型的BTV，不同血清型對牛羊的致病性不同，且型間不能產(chǎn)生交叉保護(hù)。1979年張念祖等[1]在中國云南省師宗縣首次發(fā)現(xiàn)該病并成功分離到病毒，從而證明藍(lán)舌病在該地區(qū)的存在。為了解近年來云南師宗縣藍(lán)舌病病毒活動情況，參照澳大利亞病毒監(jiān)測模式[2]，2012年在師宗縣五龍鄉(xiāng)建立了一個(gè)由10頭經(jīng)藍(lán)舌病抗體檢測為陰性、0.5～1歲的黃牛組成的監(jiān)控群（哨兵動物），從5月至10月，每周采血1次，11月和12月各采血1次，每份樣品血清經(jīng)C-ELISA、AGID檢測。本研究從轉(zhuǎn)陽性監(jiān)控動物中分離到BTV 67株，并對毒株進(jìn)行中和試驗(yàn)鑒定血清型，明確了該地區(qū)藍(lán)舌病流行情況及主要血清型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣采集 10 mL真空采血管、10 mL肝素真空采血管無菌采集監(jiān)控動物頸靜脈血液。真空采血管血液用于分離血清，肝素真空采血管血液用于分離病毒。樣品均4℃保存。

1.1.2 細(xì)胞和雞胚 蚊子細(xì)胞（C6/36）、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）或非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室）保存；10～11日齡健康雞胚購于云南云嶺廣大公司。

1.1.3 血清學(xué)檢測 C-ELISA、AGID試劑盒由本實(shí)驗(yàn)室制備；所有的抗原由本實(shí)驗(yàn)室保存的BTV-1型Y863毒株制備；中和試驗(yàn)所用的BTV 24個(gè)標(biāo)準(zhǔn)毒及24個(gè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存和制備。

1.1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 對基因庫提供的BTV各基因序列，通過軟件分析，根據(jù)BTV較為保守的VP7基因進(jìn)行序列設(shè)計(jì)引物：BTV-S7-A：5'- GTAAGT-GTA-ATC-TAA-GAG-A-3'；BTV-S7-B：5'-GTA-AGT-TTA-AAT-CGC-AAG-ACG-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1156 bp。引物由大連天寶生物工程公司合成。

1.1.5 參考毒株 Y863株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，血清型為BTV-1型。

1.1.6 主要試劑及器材 總RNA抽提試劑（TRizol）購自北京天根生化科技有有限公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plue）試劑盒、Premix Ex Taq Ver.2（loading Dye Mix）購自大連天寶生物工程公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）為Costar公司產(chǎn)品；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（IF-151）為日本SAKURA公司產(chǎn)品：倒置相差顯微鏡倒置顯微鏡DMIL-Cplan為德國萊卡公司產(chǎn)品；PCR儀9700為美國ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離[2]該病毒主要存在于被感染動物的紅細(xì)胞中。選用動物血清學(xué)轉(zhuǎn)陽前1周的肝素抗凝血100 μL，加入到含1 mL無菌PBS（pH7.2）的1.5 mL微量離心管中，顛倒混勻，200×g 離心10 min，輕輕吸棄上清，洗滌3次。棄上清加入900 μL無菌雙蒸水，渦旋混勻，確保紅細(xì)胞裂解，用1 mL注射器吸取備用。選用10～11日齡健康雞胚，在暗室內(nèi)選取貼壁血管后，標(biāo)記位置。用牙科電鉆沿標(biāo)記兩側(cè)切割，形成5 cm×10 cm的窗口，置37℃孵化箱中備用。在暗室中，進(jìn)行雞胚的靜脈接種。每份樣品接5枚胚，每枚胚注射0.1 mL。接種胚置35℃孵化箱中培養(yǎng)，逐日觀察。24 h內(nèi)死亡的胚，可認(rèn)為是非特異性死亡，棄之；24 h后死亡的胚，4℃保存。連續(xù)觀察5 d后，將活胚置4℃過夜。收集雞胚肝臟，當(dāng)1份樣品中存在死、活雞胚時(shí)，應(yīng)分開收取，該工作需在BSL-2生物安全柜中進(jìn)行。將收獲的雞胚用組織搗碎機(jī)搗碎，PBS懸浮，900×g離心10 min，取上清200 μL接種長成單層的C6/36細(xì)胞管（瓶）內(nèi)，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天在倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect, CPE）：出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管（瓶）4℃保存；未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管（瓶），凍融3次后，4℃保存。將收獲的C6/36細(xì)胞樣品接種于長成單層的BHK-21細(xì)胞管（瓶）內(nèi)，38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天在倒置相差顯微鏡觀察CPE：出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管（瓶）4℃保存；未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管（瓶），凍融3次后，4℃保存。連續(xù)在BHK-21細(xì)胞上傳3代，出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管（瓶）4℃保存，擴(kuò)大培養(yǎng)。3代都無CPE的細(xì)胞管（瓶）視為病毒分離陰性，可棄之。

1.2.2 分離病毒RNA的提取 取接毒后的單層培養(yǎng)細(xì)胞，按TRizol試劑盒方法抽提總RNA。提取的RNA進(jìn)行RT-PCR或－80℃保存

1.2.3 病毒的RT-PCR鑒定

1.2.3.1 雙鏈RNA變性 分別在PCR反應(yīng)管加入待檢和對照樣品RNA各5 μL，95℃變性5 min，速取出置于冰上。

1.2.3.2 RT-PCR擴(kuò)增 12.5 μL 2×1 Step Buffer (DyePlu)、1 μLPrimerScript 1 Step Enzyme Mix、0.5 μL BTV-S7-A (20 pmol/μL)、0.5 μL BTVS7-B (20 pmol/μL)、5.5 μL RNase-free H2O，加至PCR反應(yīng)管中，每個(gè)管中總體積為25 μL，混勻。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min，4℃保持。

1.2.4 病毒血清型的鑒定 藍(lán)舌病病毒VP2決定病毒的血清型，現(xiàn)至少發(fā)現(xiàn)24個(gè)血清型，當(dāng)前還沒有公認(rèn)的分子學(xué)方法來定型。該病毒型與型之間不能產(chǎn)生或產(chǎn)生較低的交叉保護(hù)，中和試驗(yàn)作為經(jīng)典的定型方法一直在使用。分離毒株在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代后[4]，用24個(gè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，且樣品陽性血清用24個(gè)標(biāo)準(zhǔn)毒進(jìn)行中和試驗(yàn)。

圖1 雞胚靜脈接種及分離株靜脈接種雞胚后的病變Fig.1 Chicken embryo intravenous inoculation with erythrocyte lysis and hemorrhages of chicken embryo inoculated with isolated strain

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離經(jīng)處理的帶有病毒的裂解紅細(xì)胞靜脈注射10～11日齡雞胚后，雞胚大多3～4 d出現(xiàn)死亡，雞胚全身出血（圖1），少部份胚末出現(xiàn)病理變化。雞胚肝組織PBS懸浮、離心，上清接種C6/36細(xì)胞傳1代轉(zhuǎn)到BHK-21細(xì)胞盲傳3代后，培養(yǎng)24 h后，鏡下可見細(xì)胞發(fā)生融合、空泡化及呈現(xiàn)網(wǎng)狀或放射狀等典型的CPE（圖2）；48 h可見細(xì)胞大片融合；72～96 h融合細(xì)胞死亡脫落。共分離到86份疑似分離物。根據(jù)采血時(shí)間、動物耳號依次排列命名樣品，一個(gè)號碼對應(yīng)同時(shí)采集的一份血清及同一份肝素全血。疑似分離物的命名根據(jù)分離到該分離物肝素全血的號碼命名。

圖2 接種分離株96 h 后BHK-21細(xì)胞的病變（200×）Fig. 2 Cytopathic effect of BHK-21 cell at 96 h post-inoculation（200×）A: 正常培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞； B: 分離株感染后的BHK-21細(xì)胞A: Normal BHK-21 cell; B: BHK-21 cell inoculated with isolates

2.2 分離病毒株的鑒定86份疑似分離物接種在BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)細(xì)胞病變，48 h后CPE范圍明顯擴(kuò)大。當(dāng)70%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，凍融3次，離心取上清，RT-PCR進(jìn)行鑒定，同時(shí)設(shè)BTV-1型的Y863株為參考毒株。瓊脂糖凝膠顯示，67份分離株和Y863株在1156 bp位置處有光亮條帶，與理論預(yù)期相符（見圖3）。據(jù)此，初步確認(rèn)67份分離株均為藍(lán)舌病病毒。

圖3 RT-PCR鑒定分離株Fig.3 RT-PCR result of virus isolatedM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL4000); 1～16: 以引物BTV-S7-A/B擴(kuò)增分離株; 17: 以引物BTV-S7-A/B擴(kuò)增Y863株M: DNA Marker (DL4000); 1-16: Isolated strains (BTV-S7-A/B); 17: Y863 (BTV-S7-A/B)

2.3 分離株及對應(yīng)血清的中和試驗(yàn)86份疑似分離物、與之對應(yīng)血清用藍(lán)舌病標(biāo)準(zhǔn)毒株、藍(lán)舌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清完成了病毒中和試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)。結(jié)果表明，67份毒株為藍(lán)舌病病毒，與RT-PCR結(jié)果一致。中和試驗(yàn)顯示，67份毒株中，23株BTV-1型、5株BTV-9型、17株BTV-16型。

2.4 毒株VP2序列與分析 藍(lán)舌病病毒的VP2基因決定病毒的血清型。為進(jìn)一步鑒定中和試驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)選取新分離的BTV-1型編號為120168株和BTV-16型編號為120271株進(jìn)行VP2基因測序，120168株獲得基因片段大小為636 bp。序列與同型Y863（KC879616）毒株進(jìn)行BLAST比對，兩者同源性為92%；120271株獲得基因片段大小為633 bp，序列與BTV-16型登錄號AB686221的毒株同源性為99%，見圖4～5。RT-PCR結(jié)果與中和試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 120168株、Y863株BTV的VP2基因序列同源性分析Fig. 4 Homoloy analysis of VP2 sequence of BTV strain 120168 and Y863

圖5 120271株、AB 686221株BTV的VP2基因序列同源性分析Fig.5 Homoloy analysis of VP2 sequence of BTV strain 120271 and AB686221

3 討論

1979年張念祖等[1]在中國云南省師宗縣首次發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病并成功分離到病毒，此后湖北?。?983）、安徽?。?985）、四川?。?988）、山西?。?993）、廣西壯族自治區(qū)（1985）等地均報(bào)道了該病的發(fā)現(xiàn)，其地理位置為北緯35度至37度以南的地區(qū)。近年來，受全球氣候變化及畜產(chǎn)品貿(mào)易、動物流動的影響，藍(lán)舌病在全球逐漸蔓延，呈現(xiàn)出向北方、高緯度蔓延的流行趨勢，通過血清學(xué)檢測，吉林省、遼寧省等北方省及新疆維吾爾自治區(qū)和西藏自治區(qū)海拔比較高的地區(qū)也發(fā)現(xiàn)該病的存在[1,6]。這些地區(qū)的環(huán)境不適合庫蠓的生長和繁殖，在沒有傳播媒介的情況下發(fā)生藍(lán)舌病的可能性很小，分析認(rèn)為可能是通過貿(mào)易將染病的綿羊帶到這些地區(qū)，也有可能是因?yàn)閭鞑ッ浇閹祗愤m應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)，變異出適應(yīng)高海拔及寒冷環(huán)境的品種，從而對藍(lán)舌病進(jìn)行傳播，該現(xiàn)象與2008年在歐洲出現(xiàn)的情況相似[5,7]。建立監(jiān)控群作為哨兵動物，對藍(lán)舌病的預(yù)警、風(fēng)險(xiǎn)評估、流行病的研究可以起到重要作用。

本研究對藍(lán)舌病病毒分離采用《澳大利亞動物疫病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》中的病毒分離方法。雖然該方法BTV分離需較長時(shí)間（35～40 d），但能獲得更多的毒株。我們發(fā)現(xiàn)，從C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)到BHK-21細(xì)胞傳1代，往往不會出現(xiàn)CPE，CPE更多出現(xiàn)在BHK-21第2代乃至第3代。

世界衛(wèi)生組織（OIE）2012修訂的《陸生動物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》中RT-PCR被列為藍(lán)舌病病毒鑒定的國際貿(mào)易指定試驗(yàn)之一，采用RT-PCR可快速鑒定感染動物血液和其他組織中的BTV核酸，具有很好的特異性和靈敏性，常用作病毒的實(shí)驗(yàn)室鑒定。本研究通過RT-PCR檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的核酸，共檢測出67份核酸陽性，與病毒中和試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)結(jié)果一致。

師宗縣是我國第一個(gè)發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病的地區(qū)，一個(gè)工作周期（2012年的5月～12月），共分離到藍(lán)舌病病毒67株。由于分毒工作的連續(xù)性，雖然不排除不同牛在同一時(shí)間或同一頭牛在不同時(shí)間段上分離到的病毒從序列上看是同一株，但僅僅4個(gè)月的時(shí)間，組成監(jiān)控群的10頭監(jiān)控動物藍(lán)舌病全部轉(zhuǎn)陽，說明本病在該地區(qū)廣泛存在。分離株與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及分離株對應(yīng)的樣品血清與24個(gè)標(biāo)準(zhǔn)毒的中和試驗(yàn)表明，該地區(qū)存在有BTV-1、BTV-9、BTV-16三個(gè)血清型。本研究為進(jìn)一步開展相關(guān)的病原學(xué)基礎(chǔ)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BLUETONGUE VIRUS IN 2012 IN SHIZONG COUNTY OF YUNNAN PROVINCE

XIAO Lei, MENG Jin-xin, LI Nan, GAO Lin, HE Yu-wen, YANG Heng, HU Qi, LI Hua-chun, ZHU Jian-bo
( Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China)

The sentinel herd of 10 cattle was established in 2012 to monitor epidemiology of Bluetongue virus in Shizong county of Yunnan Province. Blood samples were taken weekly from May to October and then monthly from November to December 2014 and tested for serological response in C-ELISA and for virus isolation. The sero-conversion was revealed in August in some animals and then in November in whole sentinel herd. The erythrocyte preparations from blood samples were inoculated into chicken embryo veins. Chicken liver tissues were harvested, homogenized in PBS and centrifuged. The supernatants were inoculated into C6/36 cells and passaged in BHK-21 three times. The cytopathic effect (CPE) was observed in cell monolayers. The resulting 86 virus isolates were characterized in RT-PCR and virus neutralization (VN). The VP7 gene of Bluetongue virus was amplifi ed in conventional RT-PCR using two pairs of primers designed according to the sequences in GenBank. A 1156 bp fragment of VP7 gene was amplifi ed in RT-PCR from 67 out of 86solates. The virus neutralization was performed using 24 reference bluetongue viruses and 24 positive sera. Again, the same 67 isolates were confi rmed as Bluetongue virus. The VP2 gene of two isolates was sequenced. One isolate was determined to be BTV-1 as it shared 92% identity with the reference strain Y863 (KC879616) and another isolate was BTV-16 as it shared 99% identity with the reference strain AB686221. The VN results also had an agreement with VP2 sequencing. In conclusion, 67 isolates isolated from the sentinel herd belonged to Bluetongue virus, indicating the virus transmission among bovine herds.

Bluetongue virus ; isolation; identifi cation

S852.659.4

A

1674-6422（2014）04-0001-06

2013-11-19

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（2010ZC226）；國家公益性行業(yè)項(xiàng)目（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)（201303035）

肖雷，男，碩士，副研究員，主要從事動物病毒學(xué)研究

朱建波，E-mail: ZhuJb@126.com