屠亦文，郝瑞福

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院，北京 100078)

胰島素抵抗(IR)是指一定量的胰島素與其特異性受體結(jié)合后生物效應(yīng)低于正常，表現(xiàn)為外周組織尤其是脂肪、肌肉組織對葡萄糖的攝取障礙及肝葡萄糖輸出增多[1]。目前用于胰島素抵抗的細(xì)胞模型主要選擇脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和肝細(xì)胞3種。其中，3T3-L1脂肪細(xì)胞株是國內(nèi)外廣泛用于研究胰島素抵抗機(jī)制的細(xì)胞株[2]，分化完全的3T3-L1脂肪細(xì)胞具有對胰島素的高敏感性,并且具有較好的穩(wěn)定性，因此3T3-L1脂肪細(xì)胞是研究體外胰島素抵抗的理想模型。中藥及其有效成分在改善IR方面的作用已被臨床證實和廣泛應(yīng)用,3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型以及中藥干預(yù)作用的研究也不斷深入。

1 胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞模型

1.1 高糖高胰島素 高糖高胰島素狀態(tài)下誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型是目前較為常見的造模方法，此方法較為成熟，且模型相對穩(wěn)定。易屏等[3]將誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞用5 mmol/L葡萄糖加0.6 mmol/L的胰島素作用18 h,可使3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制達(dá)60%。于樂[4]、李冀[5]等均采用高濃度葡萄糖(25 mmol/L)聯(lián)合高濃度胰島素(1×10-6mol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，建立了3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。吳漢榮等[6]的研究則顯示，在低濃度葡萄糖狀態(tài)下,胰島素明顯增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，而在高濃度葡萄糖刺激下，胰島素促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的作用明顯減弱，可見高濃度葡萄糖可致細(xì)胞對胰島素的敏感性減弱，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。Ge X M等[7]認(rèn)為，長時間異常水平的胰島素作用同樣能使細(xì)胞產(chǎn)生IR。同時,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)速率也受葡萄糖濃度的影響。鑒于此種觀點,官濱斌等[8]在誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型的過程中將各組均給予相同濃度的低糖DEME,并給予胰島素作用30 min，減少了由于葡萄糖濃度差異和胰島素作用時間過長帶來的誤差，較正確地反映出細(xì)胞糖代謝能力和胰島素敏感性。

1.2 游離脂肪酸 Lu H等[9]利用含0.5 mmol/L游離脂肪酸(FFA)的10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育24 h后，可以建立3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。張靜等[10]研究表明，經(jīng)0.25 mmol軟脂酸(PA)或油酸(OA)體外作用6 h，3T3-L1脂肪細(xì)胞即可產(chǎn)生胰島素抵抗，并且隨作用時間延長和濃度增加而加重。同時發(fā)現(xiàn)高濃度PA長時間作用，基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖攝取亦顯著下降。Boden等[11]則認(rèn)為循環(huán)中FFA濃度過高以及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過多,既導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞分泌胰島素功能缺陷，又導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，此為FFA的“脂毒性”作用。佘美華等[12]將誘導(dǎo)成功的脂肪細(xì)胞用FFA或不用FFA分別處理6 h,然后用不同濃度的胰島素誘導(dǎo)進(jìn)行葡萄糖攝取的研究。結(jié)果顯示,未加處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞隨著胰島素濃度的增加其葡萄糖攝取量逐漸增加,而在較低濃度胰島素刺激下，F(xiàn)FA處理的脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝入量變化不明顯。

1.3 TNF-α和IL-6 有研究證實，炎癥因子也可誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗,如Liu Kang等[13]采用TNF-α和IL-6的條件培養(yǎng)基持續(xù)刺激分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，炎癥通路被激活，TNF-α和IL-6基因表達(dá)及蛋白釋放均顯著增加，胰島素信號通路則受到抑制。郭紅輝等[14]的研究則表明,TNF-α或H2O2處理6 h，脂肪細(xì)胞在胰島素刺激后對葡萄糖的攝取能力明顯降低,12 h后可以判定脂肪細(xì)胞處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。同時發(fā)現(xiàn),實驗所采用的TNF-α或H2O2處理濃度和處理時間所產(chǎn)生的對細(xì)胞胰島素敏感性的抑制效應(yīng)可逆，而不是由于細(xì)胞毒害作用造成的。

1.4 地塞米松 王麗靜等[15]選擇不同濃度的地塞米松與3T3-L1脂肪細(xì)胞共同孵育48 h，觀察處理前后3T3-L1脂肪細(xì)胞對胰島素短時誘導(dǎo)的葡萄糖攝取量的變化，發(fā)現(xiàn)地塞米松抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)狀態(tài)糖運(yùn)轉(zhuǎn),且呈劑量依賴性。陳立等[16]對比游離脂肪酸、地塞米松、高糖高胰島素3種目前常用的誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR的造模方法誘導(dǎo)出的IR細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率發(fā)現(xiàn)，3個造模組均可誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，并且3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。游離脂肪酸組最先失去胰島素抗性,高糖高胰島素組細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗更強(qiáng)，而地塞米松組誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抗性介于兩者之間。

1.5 其他 除此之外，還有用雌激素、葡糖胺、金屬鉻等誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗的報道。如Ge X等[17]用金屬鉻誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，結(jié)果表明，鉻治療確實能顯著抑制胰島素刺激的葡萄糖攝取和促使胰島素信號衰減。但是相對文獻(xiàn)較少，有待進(jìn)一步深入研究。

2 中藥有效成分對3T3-L1脂肪細(xì)胞IR干預(yù)作用

劉芳芳等[18]對黃連丸(黃連、生地黃)的有效成分小檗堿加梓醇對地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的研究表明,兩種中藥均能增加葡萄糖消耗和轉(zhuǎn)運(yùn)，改善胰島素抵抗，其作用不依賴胰島素的存在，其配伍存在協(xié)同作用，并且能下調(diào)PPAR-γmRNA的表達(dá)，從而抑制前脂肪細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞，減少肥胖的發(fā)生。易屏等[3]研究小檗堿對3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞模型PI-3K p85蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，小檗堿可以明顯改善游離脂肪酸和高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗，其分子機(jī)制可能與小檗堿提高PI-3K p85蛋白的表達(dá)有關(guān)。李迪等[19]研究酸味中藥(如五味子、山楂、烏梅等)中的一種三萜類化合物熊果酸對3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的干預(yù)作用。結(jié)果表明,熊果酸在改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型糖代謝的同時可抑制脂肪細(xì)胞的分化,這一機(jī)制可能與熊果酸上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型CAP-mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)。殷惠軍等[20]研究表明,西洋參莖葉總皂苷可改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，其機(jī)制可能與其促進(jìn)脂肪細(xì)胞CAP基因轉(zhuǎn)錄、GLUT-4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。李冀等[21]研究西洋參活性成分20(R)人參皂苷Rb1、20(R)人參皂苷Rb2、人參皂苷R3、擬人參皂苷F11發(fā)現(xiàn)，西洋參活性成分可以通過對高糖高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞模型FFA、IL-6、INF等脂肪細(xì)胞因子分泌的影響，調(diào)節(jié)脂代謝,從而達(dá)到改善胰島素抵抗的目的。何燕銘等[22]研究蒲黃的主要成分蒲黃總黃酮對高糖高胰島素誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型的影響，結(jié)果表明，蒲黃總黃酮能顯著增加3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和消耗，同時可減少FFA溢出，通過調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝改善胰島素抵抗,除了改善脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取，亦可提高其儲脂能力,減少外周FFA的濃度。劉聰?shù)萚23]的研究則顯示，靈芝多糖可改善地塞米松聯(lián)合胰島素誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗,其機(jī)制可能與靈芝多糖提高了胰島素抵抗細(xì)胞的PI-3K p85和GLUT4蛋白表達(dá)相關(guān)。劉清霞等[24]觀察番石榴葉三萜化合物積雪草酸對小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖、分化以及胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響發(fā)現(xiàn)，積雪草酸能顯著改善脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗和減少游離脂肪酸的產(chǎn)生，其機(jī)制可能是其下調(diào)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子PTP1B的表達(dá)，增強(qiáng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而改善胰島素抵抗。胡銳等[25]研究葛根素對3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增值和誘導(dǎo)分化的影響,以及在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的作用，結(jié)果表明，葛根素對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖無明顯影響，能夠促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的分化，增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖代謝，且具有量效關(guān)系。于樂等[4]的研究顯示,附子多糖在對脂肪細(xì)胞毒副作用較小的基礎(chǔ)上可促3T3-L1脂肪細(xì)胞對葡萄糖的消耗,并可促進(jìn)胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞對3H-葡萄糖的攝取。郭曉農(nóng)等[26]研究地黃寡糖對脂肪細(xì)胞增殖和胰島素抵抗的影響發(fā)現(xiàn)，地黃寡糖可以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的增殖,抑制脂肪細(xì)胞的增殖,地黃寡糖對地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗具有明顯的改善作用。陳思凡等[27]研究白藜蘆醇(Res)對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，結(jié)果表明，Res可以明顯改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1細(xì)胞葡萄糖代謝。其機(jī)制可能是通過增加脂聯(lián)素、瘦素表達(dá),降低抵抗素表達(dá)從而介導(dǎo)AMPKα磷酸化實現(xiàn)的。

3 小結(jié)

綜上所述，目前關(guān)于脂肪細(xì)胞IR模型的建立大多采用3T3-L1脂肪細(xì)胞分別與不同的誘導(dǎo)因子共同培養(yǎng)誘導(dǎo)，這些誘導(dǎo)因子主要包括:高胰島素、高葡萄糖、游離脂肪酸、TNF-α、IL-6、地塞米松、金屬鉻、雌激素、葡糖胺等，而3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型作為目前研究相對成熟的IR模型，具有穩(wěn)定、可靠、易于重復(fù)等優(yōu)點，中藥在改善胰島素抵抗方面具有明顯的優(yōu)勢，目前已證實小檗堿加梓醇、小檗堿、熊果酸、西洋參莖葉總皂苷及其他活性成分、蒲黃總黃酮、靈芝多糖、附子多糖、地黃寡糖、積雪草酸、白藜蘆醇、葛根素等中藥有效成分具有改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的作用，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究由此可見,胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞模型對于在細(xì)胞及分子水平研究胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制，以及改善胰島素抵抗藥物的篩選及其機(jī)制研究，都具有十分重要的意義。而中藥有效成分對于胰島素抵抗和葡萄糖代謝干預(yù)作用及其機(jī)制的深入研究，尚有較大的空間。

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