代玉華 趙忠懿 程 鵬 劉麗娟 公茂慶**

(1.山東省醫(yī)學科學院，山東省寄生蟲病防治研究所，山東濟寧 272033；2.河南出入境檢驗檢疫局；鄭州 450003)

蚊蟲傳播的瘧疾、登革熱、黃熱病和日本腦炎等疾病每年威脅著幾億人的健康，并導致上百萬人的死亡。蚊媒傳染病防控的重要手段是控制蚊蟲種群數量和密度。防治媒介蚊蟲的傳統(tǒng)方法主要是采用化學殺蟲劑進行滅殺，但化學殺蟲劑的大量使用，不僅造成環(huán)境的污染，還導致蚊蟲抗藥性的不斷擴散和增強。如何利用蚊蟲的生理特征探索更環(huán)保、有效的防治途徑是如今研究的熱點。

嗅覺系統(tǒng)影響著蚊蟲對棲息地的選擇、繁殖、覓食、吸血、趨避及信息傳遞等行為。嗅覺感應器是蚊蟲感知周圍環(huán)境中化學氣味小分子的單位，分布于蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)——觸角與下顎須(Syedetal.,2007)。嗅覺感受器形態(tài)各異且數量很多，它們的表皮上有許多細小的孔洞，化學氣味小分子就利用這些孔洞進入。嗅覺感受器中分布著嗅覺神經樹突，在神經樹突表面存在許多嗅覺受體蛋白(Olfactory receptors,ORs)，這些受體蛋白感知到化學氣味小分子后將信息傳遞到昆蟲大腦。大腦綜合了各種信息后發(fā)出指令，從而影響到蚊蟲的行為。近年來隨著生物信息學及分子生物技術的發(fā)展,蚊蟲中參與嗅覺信號轉導過程中的一些重要蛋白被克隆和鑒定。主要包括目前發(fā)現(xiàn)的嗅覺受體蛋白、氣味結合蛋白(Ordorant binding proteins,OBPs)和氣味降解酶(Odor degrading enzymes,ODEs)等。嗅覺受體作為嗅覺系統(tǒng)的關鍵成分之一，其研究是認識蚊蟲化學信號分子識別機制的重要環(huán)節(jié)，對于開發(fā)更有效的行為調控技術進行蚊蟲防治也具有重要價值。

1 蚊蟲嗅覺受體蛋白的特征

1991年由Buck 和Axel在哺乳動物鼠類中首次發(fā)現(xiàn)OR蛋白，而昆蟲的OR蛋白是1999年由3個實驗室同時在果蠅Drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn) (Clyneetal.,1999; Gaoetal.,1999; Vosshalletal.,1999)。隨著許多生物物種的基因組被測定，目前已經獲得1個OR大家族。在蚊蟲中，岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦庫蚊Culexpipiensquinquefasciatus分別有79、131、180個OR(Hilletal.,2002; Bohbotetal.,2007; Arensburgeretal.,2010)已經被識別。Scialo等(2012)鑒定出首個白紋伊蚊Ae.albopictus的OR(AalOR2)。

蚊蟲的OR是一類 G蛋白偶聯(lián)蛋白(G-protein coupled receptor,GPCR)，通常具有7個跨膜區(qū)域，并分布于嗅器中的樹突表面(Hallemetal.,2006a)，整個蛋白的氨基酸殘基為400～600 個且與脊椎動物及線蟲OR的同源性極低。但也有研究報道，由于昆蟲OR蛋白的N末端在胞內，而C末端在胞外，所呈現(xiàn)的膜拓撲學結構與哺乳動物OR截然相反，從嚴格意義上講，昆蟲的OR不應屬于G偶聯(lián)蛋白(Bentonetal.,2006b)。在岡比亞按蚊中進行的OR結構分析進一步證實昆蟲的OR不同于典型的G蛋白偶聯(lián)受體(Tsitouraetal.,2010)。昆蟲氣味受體的類型可以分為7次跨膜受體、昆蟲味覺受體、谷氨酸受體和離子型受體(Kauppetal.,2010)。

2 嗅覺受體的表達與功能

昆蟲的一個嗅覺神經元可以表達1～3個OR蛋白(Vosshalletal.,1999)，而哺乳動物的一個神經元只表達一種受體蛋白(Mombaerts,2004)。盡管多數生物都表達數百種OR 蛋白,但氣味分子的數目遠遠多于OR 的數目。每種OR可以感受多種氣味分子，多種OR還可以感受同一種氣味分子，由此不同的OR 組合就可以檢測不同的氣味分子(Malnicetal.,1999)。數量有限的OR可以通過變化不同組合來檢測所有氣味分子。這樣組成了感受化學信息的編碼譜(Dobritsaetal.,2003; Hallemetal.,2006a,2006b; Vosshalletal.,2007)。

有些OR 基因可以進行共表達。在對岡比亞按蚊CO2受體的研究中發(fā)現(xiàn)，可感受CO2的受體基因Gr21a和Gr63a，GPRGR22 和GPRGR24 表現(xiàn)出共表達(Jonesetal.,2007)。還有研究發(fā)現(xiàn)OR 基因的表達有一定的性別依賴性。采用RT-PCR 和qRT-PCR 技術來比較雄性按蚊和雌性按蚊OR mRNA 的表達水平，結果顯示宿主氣味物質更容易激活雌性個體OR 的表達(Iatrouetal.,2008)。另外，OR 基因的表達與昆蟲宿主之間還存在協(xié)同進化的現(xiàn)象，宿主的種類和數量會影響OR基因的表達(Mcbrideetal.,2007)。

第一個獲得功能鑒定的昆蟲OR是果蠅Or43a。Wetzel 等(2001)在非洲蟾蜍卵母細胞中注射Or43a cRNA 和G 蛋白的Gα15 亞基， 雙電極電壓鉗的結果顯示，較低濃度的環(huán)己酮、環(huán)己醇、苯甲醛和苯甲醇等氣味分子即可激活Or43a 受體，而1，3-環(huán)己二酮、1，4-環(huán)己二酮、甲苯、3-苯甲醛、苯乙醛和正己醇等類似物卻不能激活它們。

OR2是蚊蟲中進行功能研究較多的OR蛋白。Carey等(2010)利用膜片鉗技術，在爪蟾卵細胞中表達岡比亞按蚊的OR復合物，研究結果表明，同果蠅一樣，岡比亞按蚊的OR復合物也分為兩種類型，識別譜較窄的受體(Specialist)和廣譜識別受體(Generalist)。每一種岡比亞按蚊的OR都有特定的氣味反應特征和識別范圍，并且，有些氣味可以激活某些嗅覺神經元而抑制其他嗅覺神經元。在岡比亞按蚊中，AgOR2屬于識別譜較窄的受體，對一部分氣味產生反應，如：庫蚊的產卵引誘劑，與人類汗液氣味有30%相似性的吲哚(Meijerinketal.,2001)。Xia等(2008)發(fā)現(xiàn)，AgOR2不但在岡比亞按蚊成蟲中表達，也在幼蟲中表達，并參與2-甲酚、苯甲醛、吲哚和3-甲基吲哚的識別。有研究表明，致倦庫蚊(Pelletieretal.,2010)和埃及伊蚊(Bohbotetal.,2011a)的OR2同源性較高，且都對吲哚產生反應。Scailo等(2012)從白紋伊蚊中克隆出第一個OR蛋白AalOR2，它對吲哚具有識別特性，該蛋白在幼蟲頭部和成蚊觸角中表達，且與其他蚊蟲的OR2同源性較高，說明OR2是蚊蟲OR蛋白家族中的重要保守蛋白。

利用爪蟾卵母細胞表達岡比亞按蚊的OR(AgORs)，研究OR的改變帶來的影響，結果表明OR不僅參與對抗、逃逸等行為，還參與蚊蟲間的合作行為，暗示利用阻斷OR途徑，可控制蚊蟲行為，開拓蚊蟲防制的新思路(Bohbotetal.,2012)。

有關昆蟲OR在神經系統(tǒng)信號轉導中的作用，一般認為與哺乳動物的OR相同，是引起G偶聯(lián)蛋白的β亞基或α亞基分離，通過改變離子通道，再引起動作電位。然而，有研究表明，利用基因敲除技術和膜片鉗技術，發(fā)現(xiàn)昆蟲的OR在信號傳導中有其特殊性，即OR可以直接作為離子通道，而引起動作電位(Satoetal.,2008; Wicheretal.,2008)，這一發(fā)現(xiàn)豐富了人類認識動物信號轉導的機制。

3 Or83b蛋白

OR基因在不同物種之間的同源性比較低，但有一個例外，那就是結構和功能高度保守的Or83b。它存在于幾乎所有的昆蟲中(Larssonetal.,2004; Jonesetal.,2005；Hallemetetal.,2006b; Xiaetal.,2006)，形成了一個特殊的Or83b 家族。這種在不同昆蟲種間高度保守的 OR首先在果蠅基因組內發(fā)現(xiàn)，命名為DOR83b(Vosshalletal.,1999)。目前國內外已從雙翅目、鱗翅目、膜翅目和鞘翅目等一些昆蟲中發(fā)現(xiàn)這種基因(Hilletal.,2002; Kriegeretal.,2003; Xiaetal.,2006; 王妮娜等，2008; Jordanetal.,2009)。Or83b受體的另一個特征是在很多昆蟲種類中，不同昆蟲間氨基酸序列表現(xiàn)出約70%的同源性(Hilletal.,2002; Kriegeretal.,2003; Pittsetal.,2004)；對水稻害蟲的研究發(fā)現(xiàn)，鱗翅目昆蟲之間該基因的氨基酸序列相似性達94%，與致倦庫蚊、岡比亞按蚊、埃及伊蚊相比，氨基酸序列相似性達到83%。

這種在各類昆蟲中同源性高的、在進化中保留下來的OR，則可能在昆蟲的嗅覺中起著獨特和基礎的作用。以果蠅、岡比亞按蚊和夜蛾等昆蟲為實驗材料，利用基因缺失突變體研究這幾種昆蟲氣味受體的功能，將其Or83b 基因敲除后，突變體表現(xiàn)出嗅覺相關行為功能被嚴重削弱,而基因拯救后可以恢復正常(Larssonetal.,2004; Jonesetal.,2005)，表明Or83b 基因在昆蟲嗅覺行為中具有重要作用(Wicheretal.,2008)。推測Or83b受體可能具有以下兩種功能：一是在某個嗅覺感受神經元內它能夠獨立地結合特殊的配體，而和它共表達的其他OR則不能結合；二是它可能協(xié)助其他的OR基因，通過與其二聚體化來識別多樣的氣味物質(Larssonetal.,2004)。相對單獨表達普通氣味受體對氣味分子的反應來說，在異源表達系統(tǒng)(Heterologous expression system)中共表達Or83b和普通氣味受體后，對氣味分子的識別反應顯著增強，暗示Or83b 和普通氣味受體形成的復合物可能是昆蟲感受氣味分子的真正受體(Nakagawaetal.，2005；Satoetal.，2008)。在不表達Or83b 受體家族的昆蟲嗅覺感覺神經元中，也存在著多種受體以復合物的形式來完成對氣味分子的感受功能(Kwonetal.，2007；Jonesetal.，2007；Bentonetal.，2009)。

另外，在研究岡比亞按蚊和果蠅對CO2的識別功能時，發(fā)現(xiàn)這種識別作用依賴于兩種非Or83b 嗅覺受體，這兩種受體在同一個神經元內共表達(Jonesetal.,2007)。這個實驗結果說明昆蟲神經—受體一對一表達很可能不是唯一的方式，也暗示昆蟲嗅覺基因的表達調控更為復雜。

4 神經膜蛋白(Sensory neuron membrane protein,SNMP)

在鱗翅目昆蟲嗅覺的研究中，從美洲野蠶Antheraeapolyphemus嗅覺感受神經元細胞膜提取物中純化并克隆了一組SNMP，免疫學分析表明該蛋白只在嗅覺感受器纖毛、樹突和神經元胞體中存在(Rogersetal.,1997)。序列分析表明它存在兩個跨膜結構和一個較大的胞外環(huán)，類似于脊椎動物CD36家族的蛋白(一種類似于受體的膜蛋白)。CD36 家族是可以結合并且運輸脂肪的跨膜蛋白,這類蛋白的功能是識別細菌的受體,在免疫系統(tǒng)中的組成部分(Vosshalletal.，2007)。SNMPs 的功能是運載氣味分子，并且與嗅覺神經元細胞外的蛋白(如OBPs)、細胞膜上蛋白(Ors)以及胞質蛋白相互作用(Bentonetal.,2007)。Nichols 等(2008)從果蠅、岡比亞按蚊和埃及伊蚊等基因組中分別鑒定了12～14種SNMP/CD36類似物。Jin 等(2008)發(fā)現(xiàn)SNMP 對于果蠅的性信息素感受神經元感受性信息素cVA 是必要的，但是對于感受一般氣味分子是不必要的。從組織分布推測SNMP可能是OR的一種。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于對OR功能特性的研究，更促進了對嗅覺途徑的多樣性的認識。

5 蚊蟲驅避劑

目前仍占有一定市場的蚊蟲驅避劑包括驅蚊胺(N,N-Diethyl-meta-toluamide,DEET)、羥哌酯(2-(2-羥乙基)-哌啶-1-碳酸-1-甲基異丙酯，KBR3023)、驅蚊酯(3-(N-正丁基乙酰胺基)-丙酸乙酯，IR3535)等。驅蚊胺是市場份額最大的驅蚊制品(Katzetal.,2008)，這種化合物的作用機理一直沒有定論。一種說法是蚊蟲不喜歡驅蚊胺的氣味，另一種說法是它屏蔽蚊蟲對其他化學氣味的感知。研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用一些化學氣味時，蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)會產生明顯的神經反應，而這些化學氣味與驅蚊胺一起使用時，蚊蟲的神經反應顯著減弱。說明驅蚊胺明顯干擾蚊蟲對其他化學小分子的感知能力，從而認為驅蚊胺屏蔽了蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)(Ditzenetal.,2008)，但也有報道稱是由于驅蚊胺吸附了其他化學分子從而降低了它們發(fā)揮的量，才導致蚊蟲的神經反應能力下降(Syedetal.,2008)。還有研究認為多種驅避劑的作用機制是抑制氣味引發(fā)的OR介導的電流(Bohbotetal.，2011b)。

蚊蟲的氣味受體復合體包括一個特異性OR(ORx)和一個共受體(Orco)，細胞表面的神經傳輸和信號轉換都需要Orco的參與。在埃及伊蚊體內，驅蚊胺是通過降低嗅覺感受神經(ORN)對于乳酸(Bernier,2002)的敏感閾值表現(xiàn)對已有氣味的抑制作用。驅蚊胺選擇性的抑制氣味介導的OR8，而驅蚊酯、羥哌酯抑制OR2和OR8，3種驅避劑都不作用于共同受體Or83b(Ditzenetal.,2008; Bohbotetal.，2010; Bohbotetal.，2011b)。此外，驅蚊胺和驅蚊酯的識別位點并不在Orco上，且對Orco 無親和力(Bohbotetal.，2012)。

2011年美國范德比爾特大學的研究人員在研究蚊蟲嗅覺基本原理時發(fā)現(xiàn)一種化合物驅避劑，命名為VUAA1，這是一類新的嗅覺共受體激動劑，該類化合物具有比驅蚊胺強1 000倍的效果(Jonesetal.,2011)。與傳統(tǒng)驅避劑不同，VUAA1的原理是直接激活Orco而不是單獨激活某個ORx，它刺激所有的ORx-Orco連接。從理論上講，VUAA1理論上可以激動所有表達Orco的ORNs，使蚊蟲覺得這種“氣味”是超負荷的存在，由此使蚊蟲基本喪失嗅覺分辨力，辨別不出血液或者其他任何味道，也就無法搜尋到人體(向婧潔等，2013)。

6 展望

嗅覺系統(tǒng)在蚊蟲的生命活動中起著關鍵作用，直接影響蚊蟲感受外界環(huán)境和尋找宿主等行為。OR在嗅覺系統(tǒng)中占據十分重要的地位。近年來在OR結構、受體蛋白、表達及功能等方面進行了大量研究并取得進展，但是，有關蚊蟲OR的作用機制、表達調控等諸多問題亟待探索。基于OR的蚊蟲驅避劑研究初步表明，通過作用于OR可以形成對蚊蟲嗅覺系統(tǒng)的干擾甚至阻斷，也預示著以OR為基礎研發(fā)高效廣譜性蚊蟲驅避劑成為可能。同時，蚊蟲OR的研究，也為建立OR介導的蚊媒病傳播阻斷途徑提供科學依據。