張冬冬，邢 婧，戰(zhàn)文斌

（中國海洋大學(xué)教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室，山東 青島266003）

血細(xì)胞是貝類免疫防御的主要組成部分，不僅參與吞噬、包囊、胞吐及活性氧產(chǎn)生等細(xì)胞免疫，還通過分泌和釋放各種免疫因子參與體液免疫[1－2]，血細(xì)胞及其亞群的數(shù)量變化是貝類的重要免疫指標(biāo)之一。貝類血細(xì)胞一般分為顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞兩大類，前者具有更強(qiáng)的吞噬力及活性氧產(chǎn)生量[3－4]，是貝類細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞群。眾多研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子如溫度[5－8]和干露[9－11]，外源刺激[12－15]及饑餓、生殖等[16－19]均會引起貝類血細(xì)胞及其亞群數(shù)量的變化。

櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）是我國北方主要的養(yǎng)殖貝類，水溫是影響其免疫防御的重要環(huán)境因子。有研究發(fā)現(xiàn)過高的水溫是扇貝大規(guī)模死亡發(fā)病的主要原因之一[5，20－21]，水溫的驟然改變會引起貝類血細(xì)胞吞噬率、活性氧產(chǎn)量及酶活性等免疫指標(biāo)的變化[6－8]。此外，干露是貝類運輸采取的主要措施之一[22－23]，貝類暫時處于缺水低氧狀態(tài)，血細(xì)胞吞噬率、活性氧產(chǎn)量及溶菌酶酶活力均顯著降低[9－11]，但在不同溫度下干露處理后血細(xì)胞及其亞群數(shù)量變化的報道較少，且對血細(xì)胞數(shù)量的檢測多是應(yīng)用血球計數(shù)法[9]或流式細(xì)胞術(shù)[6－8，10－11]。本文應(yīng)用血細(xì)胞單克隆抗體，通過測定與血細(xì)胞結(jié)合的抗原決定簇數(shù)量變化的間接ELISA方法，以吸光值的變化間接反映血細(xì)胞相關(guān)抗原的變化[24－25]，尤其是顆粒血細(xì)胞單抗的應(yīng)用能夠從抗原抗體角度單獨地監(jiān)測該重要細(xì)胞亞群的變化，且結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)[26－28]直觀地分析其占全血細(xì)胞的比例，為櫛孔扇貝血細(xì)胞及其亞群的免疫防御研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

櫛孔扇貝（Chlamysfarreri，殼長（7.0±0.3）cm）采自青島八號碼頭扇貝養(yǎng)殖場，于實驗室暫養(yǎng)備用，暫養(yǎng)水溫17℃。

1.2 單克隆抗體

抗櫛孔扇貝全血細(xì)胞單克隆抗體（單抗）1F7[29]、抗櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞單抗6H7[15]均由本研究室研制，本論文應(yīng)用二單抗的雜交瘤上清液作為酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的第一抗體。

1.3 水溫變化實驗

取暫養(yǎng)扇貝280只隨機(jī)分成4組，每組70只，分別放置于水溫為11、17、23、28℃的容器中，17℃組為對照。分別于處理后0、6、12h和1、2、3、4、5、6、7d隨機(jī)取扇貝6只，抽取血細(xì)胞，用于ELISA和流式細(xì)胞術(shù)測定。

1.4 干露實驗

取暫養(yǎng)扇貝250只隨機(jī)分成5組，每組50只，分別轉(zhuǎn)至5、11、17和23℃濕度100%的密閉無水恒溫箱，黑暗中暴露24h，之后轉(zhuǎn)入17℃海水中恢復(fù)24h，對照組為17℃海水養(yǎng)殖組。分別于干露后0、2、6、12、24h及海水恢復(fù)24h后隨機(jī)取扇貝6只，抽取血細(xì)胞，用于ELISA和流式細(xì)胞術(shù)測定。

1.5 血細(xì)胞樣品制備

以裝有預(yù)冷抗凝劑（PBSE：8g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4，0.2g KH2PO4，5.58g EDTA，加蒸餾水至1L，pH＝7.2）的無菌注射器從取樣扇貝閉殼肌血竇中以1∶1比例抽取血淋巴，之后在400×g，4℃下離心10min，以PBS重懸血細(xì)胞沉淀，再離心洗滌2次，最后以等量的PBS重懸，即為血細(xì)胞懸液。將所得血細(xì)胞懸液分成2份：一份將血細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至107cells/mL，為血細(xì)胞懸液，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測；另一份經(jīng)超聲波破碎后，為血細(xì)胞破碎液，用于ELISA。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

將血細(xì)胞破碎液包被于96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μL，4℃過夜，加入300μL含1.0%吐溫20的PBS（PBST）洗滌3次，每次5min，以0.5mol/L EDTA室溫孵育10min，抑制內(nèi)源酶活性[30]，PBST洗3次，之后加入200μL 5.0%牛血清白蛋白溶液，37℃封閉1h，PBST洗滌，然后分別加入100μL單抗1F7和6H7，37℃孵育1.5h，PBST洗3次。加100μL堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗小鼠（Sigma）二抗稀釋液，37℃孵育1h，PBST再洗3次。加100μL新配的、pNPP底物顯色液，室溫反應(yīng)20min，加50μL 2mol/L NaOH 終止顯色反應(yīng)，于酶標(biāo)儀405nm波長下讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。每組樣品重復(fù)測定3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

取500μL的血細(xì)胞懸液上樣流式細(xì)胞儀、流式細(xì)胞儀正散射光（FSC）和側(cè)散射光（SSC）分別分析血細(xì)胞的大小和胞質(zhì)顆粒度，結(jié)果應(yīng)用 WinMDI 2.9軟件分析顆粒血細(xì)胞占總?cè)?xì)胞的比例[26]。本實驗重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖；其中實驗組與對照組間，用one－way ANOVA統(tǒng)計分析差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 水溫驟變?nèi)?xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量的變化

水溫驟變，11℃組櫛孔扇貝全血細(xì)胞數(shù)量顯著增加，OD405nm值（全血細(xì)胞抗原在405nm處的吸光值）6、12h約為0.52，明顯高于對照組（17℃，0.493±0.099，P＜0.05），之后恢復(fù)到對照水平；23℃組OD405nm值顯著增加，6h達(dá)峰值（0.545±0.006），顯著高于對照組（P＜0.05），之后逐漸下降，48hOD405nm值為（0.505±0.006）與對照組無顯著差異；28℃組OD405nm逐漸下降，至24h最低（0.405±0.008），顯著低于對照組（P＜0.05），之后逐漸回升，72h 開始基本穩(wěn)定于0.442，顯著低于對照組（P＜0.05）（見圖1A）。

水溫驟變，11℃組顆粒血細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，12h OD405nm（顆粒血細(xì)胞抗原在405nm處的吸光值）值達(dá)峰值（0.540±0.010），24h下降至（0.522±0.100），之后OD405nm值變化不大，始終高于17℃水平（0.479±0.030）（P＜0.05）；23℃組 OD405nm值逐漸下降，24h達(dá)最低值 （0.403±0.006），之后逐漸上升，144h 為（0.464±0.030），與對照組無顯著差異（P＞0.05）；28℃組OD405nm值顯著降低，24h達(dá)最低值（0.364±0.006），之后逐漸上升，96h開始基本維持在0.433，顯著低于對照組（P＜0.05）（見圖1B）。

圖1 ELISA檢測水溫驟變后櫛孔扇貝全血細(xì)胞數(shù)量（A）和顆粒血細(xì)胞數(shù)量（B）的變化Fig.1 Variations of hemocyte count（A）and granulocyte count（B）in C.farreri after acute temperature challenge detected by ELISA.

水溫驟變后，櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞占全血細(xì)胞的比例有顯著變化（見圖2A）。17℃對照組，顆粒血細(xì)胞占全血細(xì)胞的比例基本穩(wěn)定在47%，對應(yīng)的流式散點圖為圖2a；11℃組顆粒血細(xì)胞比例逐漸增加，12h達(dá)峰值（65.59%±3.60%，見圖2b），之后緩慢下降，基本穩(wěn)定在60%水平，始終顯著高于對照水平（P＜0.05）；23℃組顆粒血細(xì)胞比例緩慢降低，24h下降至最低值（38.25%±1.70%，見圖2c），之后逐漸回升，96h開始與對照組無顯著差異；28℃組顆粒血細(xì)胞比例顯著下降，24h達(dá)最低值（26.07%±1.20%，見圖2d），之后逐漸上升，120h開始穩(wěn)定在39%水平，顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析水溫驟變后櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞比例變化（A）及對應(yīng)的部分流式細(xì)胞術(shù)散點圖（a，b，c，d）Fig.2 Variations of granulocyte ratio（A）in C.farreri after acute temperature challenge detected by flow cytometry and part of corresponding scatter diagrams（a，b，c，d）

2.2 不同溫度干露全血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量的變化

櫛孔扇貝不同溫度下干露處理后，5℃組全血細(xì)胞數(shù)量在2h顯著降低，OD405nm值（全血細(xì)胞抗原在405nm處的吸光值）約為0.336±0.00，顯著低于對照組（0.677±0.023）（P＜0.05），6hOD405nm值 最 低（0.278±0.009），12、24h逐漸回升，仍顯著低于對照組（P＜0.05）；11℃組 OD405nm2h 下降至0.341±0.026，6、12和24h增加至0.289±0.029，顯著低于對照組（P＜0.05）；17℃組 OD405nm24h降至最低（0.153±0.013），顯著低于對照組（P＜0.05）；23℃組櫛孔扇貝6h后死亡率達(dá)100%，2、6hOD405nm值分別為0.330±0.030和0.289±0.007，顯著低于對照組（P＜0.05）；5、11和17℃下干露處理后扇貝放回海水中恢復(fù)24h，OD405nm值分別為0.525±0.004、0.481±0.020和0.433±0.009，均低于對照水平（P＜0.05）（見圖3A）。

櫛孔扇貝不同溫度下干露處理，5℃組顆粒血細(xì)胞數(shù)量在2、6h顯著降低，OD405nm值（顆粒血細(xì)胞抗原在405nm處的吸光值）6h最低（0.290±0.020），12h、24h逐漸增加仍顯著低于對照組（P＜0.05）（見圖3B）；11℃組 OD405nm值2、6h降至0.346±0.041，12、24h OD405nm值分別為0.330±0.019和0.289±0.029，顯著低于對照組（P＜0.05）；17℃組 OD405nm值24h降至最低約為0.1218顯著低于對照組（P＜0.05）；23℃組2、6hOD405nm值分別為0.313±0.037和0.338±0.023，均顯著低于對照組（P＜0.05）；海水中恢復(fù)后，5、11和17℃組顆粒血細(xì)胞數(shù)量 OD405nm值分別為0.369±0.022、0.268±0.012和0.305±0.008，顯著低于對照組（P＜0.05）（見圖3B）。

圖3 ELISA檢測干露刺激后櫛孔扇貝全血細(xì)胞數(shù)量（A）和顆粒血細(xì)胞數(shù)量（B）的變化Fig.3 Variations of hemocyte count（A）and granulocyte count（B）in C.farreri after air exposure at different temperatures detected by ELISA

櫛孔扇貝對照組顆粒血細(xì)胞比例約為48.3%（見圖4a），不同溫度下干露處理后顆粒血細(xì)胞的比例變化顯著（見圖4A）。5和11℃組顆粒血細(xì)胞比例2、6h顯著降低，6h比例分別約為31%和29%，12h分別增加至38%和37%，24h達(dá)最低值，分別為29.27%±1.80%，31.37%±2.10%（見圖4b，c），顯著低于對照組（P＜0.05）；17℃組，顆粒血細(xì)胞比例6h顯著低于對照組，比例約為39%，24h比例最低（20.17%±1.30%，見圖4d）；23℃干露2h顆粒血細(xì)胞比例顯著降低，約為33%，6h回升至45%左右；海水恢復(fù)后，5、11和23℃顆粒血細(xì)胞比例分別約為42%，28%和32%。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析不同溫度下干露刺激后櫛孔扇貝顆粒血細(xì)胞比例變化（A）及對應(yīng)的部分流式細(xì)胞術(shù)散點圖（a，b，c，d）Fig.4 Variations of granulocyte ratio（A）in C.farreri after air exposure at different temperatures detected by flow cytometry and part of corresponding scatter diagrams（a，b，c，d）

3 討論

本文應(yīng)用全血細(xì)胞和顆粒血細(xì)胞單抗，通過測定與全血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞結(jié)合的抗原決定簇數(shù)量變化的間接ELISA方法檢測全血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量的變化，同時應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)[30－32]根據(jù)細(xì)胞大小及胞質(zhì)內(nèi)顆粒度直觀的分析顆粒血細(xì)胞占全血細(xì)胞的比例。結(jié)果表明，ELISA與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示的顆粒血細(xì)胞的數(shù)量與比例變化基本一致。

水溫突變11、23℃組全血細(xì)胞數(shù)量均有顯著增加，可能是因為水溫驟然變化，血細(xì)胞大量增殖或血細(xì)胞由組織到血淋巴間隙的移動。隨著扇貝對溫度的適應(yīng)，血細(xì)胞在血淋巴和各個組織的移動達(dá)到平衡，逐漸回復(fù)到對照水平[5]。適當(dāng)?shù)奶岣邷囟?，貝類機(jī)體代謝加快，全血細(xì)胞數(shù)量增加。但是溫度過高，28℃下血細(xì)胞數(shù)量始終低于對照組，持續(xù)高溫使活性氧累積增多損害機(jī)體細(xì)胞，導(dǎo)致血細(xì)胞死亡率增加[2，5]，全血細(xì)胞數(shù)量減少。

顆粒血細(xì)胞數(shù)量和比例在水溫降低時顯著增加并且始終高于對照水平。較低水溫下，貝類機(jī)體代謝下降，但是血細(xì)胞容量并沒有降低[31]，顆粒血細(xì)胞數(shù)量增加。溫度升高時，顆粒血細(xì)胞數(shù)量和比例有顯著的降低，貝類血細(xì)胞中起吞噬作用的主要是顆粒血細(xì)胞。隨溫度升高，血細(xì)胞尤其是顆粒血細(xì)胞的死亡率會增加，并且伴隨脫顆?，F(xiàn)象，顆粒血細(xì)胞數(shù)量及比例下降。在研究蛤（Chameleagallina）[6]、扇貝（C.farreri）[8]免疫指標(biāo)對于溫度變化的應(yīng)激中也發(fā)現(xiàn)，溫度升高有吞噬作用的血細(xì)胞比例降低。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的分裂及增殖在異常高溫下受到抑制，并且顆粒血細(xì)胞更易受到溫度的誘導(dǎo)[33]，28℃水溫下貝類機(jī)體處于嚴(yán)重脅迫狀態(tài)，血細(xì)胞的增殖減弱甚至停止，血細(xì)胞數(shù)量、顆粒血細(xì)胞數(shù)量及比例始終低于對照水平。本研究認(rèn)為，櫛孔扇貝血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量對于水溫的變化較敏感，溫度升高較多時，血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量明顯降低，免疫力較差。

當(dāng)櫛孔扇貝處于干露狀態(tài)時，溫度的影響更加明顯，23℃下干露扇貝對于低氧的耐受性較低，干露12h時全部死亡。各溫度下干露處理，血細(xì)胞數(shù)量、顆粒血細(xì)胞數(shù)量及比例均顯著降低，主要是由于櫛孔扇貝處于缺水低氧脅迫狀態(tài)，血細(xì)胞尤其是顆粒血細(xì)胞死亡率增加，此時貝類血細(xì)胞吞噬率下降，免疫力降低[11]。另外有研究者發(fā)現(xiàn)太平洋牡蠣（Crassostreagigas）、蛤（C.gallina）干露處理后血細(xì)胞總數(shù)及吞噬率均降低，而較短時間的干露能夠使貽貝（Mytilusgalloprovincialis）血細(xì)胞數(shù)量及吞噬率有顯著的增加[33]，可能與物種及實驗設(shè)置等有關(guān)。

17℃下干露12h內(nèi)，扇貝血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量無顯著變化，而溫度變化較大的5、11℃干露組細(xì)胞數(shù)量減少較快，主要是溫度變化引起。較長時間干露處理后海水中恢復(fù)，5℃組全血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量顯著高于11、17℃組，說明較低溫度干露對扇貝的損傷較小，血細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)好。實驗統(tǒng)一設(shè)置為17℃海水中恢復(fù)24h是根據(jù)生產(chǎn)實際而定，干露前后扇貝均處于最適的環(huán)境中，然后進(jìn)行不同溫度下的干露，海水中恢復(fù)主要是通過其恢復(fù)的效果來評估在不同溫度下的干露效果。本研究表明，干露后櫛孔扇貝血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞數(shù)量顯著降低，并且表現(xiàn)出明顯的溫度相關(guān)性，5℃組海水恢復(fù)效果較好，干露溫度較高達(dá)到23℃時，扇貝的死亡率較高。在實際生產(chǎn)當(dāng)中，要綜合考慮干露時間和溫度的影響，選擇合適干露條件，避免高溫干露。

綜合分析水溫變化及不同溫度下干露處理后血細(xì)胞數(shù)量的變化，表明溫度對于扇貝血細(xì)胞及其亞群的數(shù)量具有重要影響，無論是水體中還是干露狀態(tài)下，高溫均會導(dǎo)致貝類機(jī)體的血細(xì)胞數(shù)量降低，死亡率增加，并且干露狀態(tài)下貝類機(jī)體對于溫度的耐受性更低，23℃時短時間內(nèi)大量死亡。同時該研究表明，血細(xì)胞數(shù)量是衡量貝類免疫狀態(tài)的一個重要指標(biāo)，其對溫度的反應(yīng)較為敏感，扇貝的養(yǎng)殖及運輸過程中要注意避免高溫。

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