盧延旭 唐瑋瑋 許英健 朱曉凱 穆 彪

（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

新型殺蟲(chóng)劑甲維鹽的快速定性鑒別方法

盧延旭 唐瑋瑋 許英健 朱曉凱 穆 彪

（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

建立了原藥和生物檢材中新型殺蟲(chóng)劑甲維鹽的系列快速定性鑒別方法，包括理化性狀鑒別、顯色反應(yīng)鑒別、紫外鑒別、薄層鑒別和液-質(zhì)（HPLC-MS）定性鑒別等方法，借助這些快速鑒別方法可與其他類殺蟲(chóng)劑如有機(jī)磷酸酯類、氨基甲酸酯類和新型殺蟲(chóng)劑阿維菌素，以及具有十四元環(huán)/十五元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等相鑒別。

甲維鹽 十六元環(huán) 大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu) 定性鑒別

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin Benzoate，簡(jiǎn)稱甲維鹽)，是繼有機(jī)磷酸酯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲(chóng)菊酯類和新煙堿類殺蟲(chóng)劑之后的新一代具有十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的抗生素類殺蟲(chóng)劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于家庭殺蟲(chóng)、殺螨和農(nóng)業(yè)上水稻、玉米、大豆、高粱、谷物、棉花、果樹(shù)、蔬菜等的廣譜殺蟲(chóng)。近些年來(lái)，隨著甲維鹽等新型農(nóng)藥的推廣使用，因噴霧吸入，驅(qū)蟲(chóng)使用過(guò)量、誤服、投毒、自殺等各類中毒事件時(shí)有發(fā)生。為了協(xié)助公、檢、法、司系統(tǒng)法醫(yī)和化驗(yàn)室技術(shù)人員做好相關(guān)案件的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和毒物分析工作，本文首次系統(tǒng)建立了原藥和生物檢材中新型殺蟲(chóng)劑甲維鹽的快速定性鑒別方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品（Emamectin Benzoate），白色粉末，純度99.99%；3.2%甲維鹽，3.2%阿維菌素，80%敵敵畏，90%滅多威（萬(wàn)靈）；甲醇，色譜純99.9%；甲醇，分析純≥99.5%；丙酮，分析純≥99.5%；其余試劑和藥品均為市售分析純或色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備、儀器與材料

DDL-5型低速冷凍離心機(jī)、TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)；LXQ10208型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：色譜柱 Thermo Gold ODS（150.0mm× 2.1mm，5μm）不銹鋼柱，內(nèi)填DurashellC18；柱溫35.0℃；流動(dòng)相甲醇 5mmol乙酸胺 +0.2%冰乙酸+10%甲醇=80∶20（v／v）；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量10μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源(ESI)，正離子方式檢測(cè)，全離子掃描模式；掃描范圍240.00～900.00amu；毛細(xì)管溫250℃，毛細(xì)管電壓42V；源電壓5.0kV；鞘氣(N2)30arb。MD 100-2型電子天平；DL-CJ-1F實(shí)驗(yàn)醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)；FSH-2可調(diào)高速分散勻漿機(jī)；JKDP型旋渦振蕩器；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器；微量移液器；微孔濾膜等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 理化性狀鑒別

取4個(gè)陶瓷皿，分別用乳膠頭滴管加入2%甲維鹽、2%阿維菌素、2%敵敵畏和2%萬(wàn)靈4種農(nóng)藥各1ml，肉眼觀察顏色、氣味和pH值。用乳膠頭滴管依次向敵敵畏、萬(wàn)靈、阿維菌素和甲維鹽等4種農(nóng)藥原藥或染毒小白鼠的胃內(nèi)容物凈化上清液中加入等量的36%鹽酸/98%硫酸并震蕩后，觀察上述4種農(nóng)藥的顏色變化。

1.3.2 顯色反應(yīng)鑒別

將 2%甲維鹽原藥或含有甲維鹽 （＞20μg /mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液2mL置于陶瓷皿中，滴加0.1%高錳酸鉀2～3滴，觀察高錳酸鉀溶液的褪色時(shí)間。將2%甲維鹽溶液（乳白色顆粒原藥用甲醇配制而成）或含有甲維鹽（＞20μg/mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液2mL置于陶瓷皿中，加入0.1%高錳酸鉀溶液（粉紅色）2～3滴，振搖3～5分鐘后液體呈淺土黃色，再加入1%2,4-二硝基苯肼乙醇溶液（橘黃色）2～3滴，振搖3～5分鐘，觀察甲維鹽混合溶液的顏色變化。將含有甲維鹽（＞20μg/mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液2mL或濃度在20～100μg/mL之間的甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液2mL置于陶瓷皿中，加1%亞硝酸鈉3～5滴，再滴加濃鹽酸2～3滴，充分振搖后，觀察甲維鹽混合溶液的顏色變化。

1.3.3 紫外鑒別

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)甲維鹽和紅霉素甲醇溶液在243nm波長(zhǎng)處的最大吸收峰。

1.3.4 薄層鑒別

將含有甲維鹽（＞20μg/mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液或濃度在20～100μg/mL之間的甲維鹽溶液，點(diǎn)樣于硅膠G薄層板起點(diǎn)線上，采用展開(kāi)系統(tǒng)A：三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）或展開(kāi)系統(tǒng)B：乙酸乙酯-正己烷-氨（10:1.5:1.5）展開(kāi)1h，在紫外燈（UV254nm）下甲維鹽顯示斑點(diǎn)；噴霧碘蒸氣，觀察和比較甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的顯色情況和Rf值是否一致。

1.3.5 高效液相-質(zhì)譜色譜法（HPLC-MS）定性

精密稱取甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于100mL容量瓶中，標(biāo)記后用甲醇稀釋至刻度，配制成100μg/mL母液，再?gòu)哪敢喝萘科恐懈魑?mL，分別置于各自的10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制10μg/mL的甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別采集甲維鹽中毒死家兔的心血lmL，分別用3mL水稀釋，渦旋混合1min，8000r／min離心10min，上清液過(guò)Oasis? HLB固相萃取柱，(預(yù)先以1mL甲醇，1mL水活化)，以1mL50%甲醇水溶液淋洗雜質(zhì)，棄去，吸取1.0mL甲醇液洗脫測(cè)定物，收集洗脫液，過(guò)0.2μm微孔濾膜，進(jìn)樣10μL供HPLC／MS檢測(cè)用。分別采集甲維鹽中毒死家兔的心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、胃組織1g，加丙酮∶水（3∶1）至10mL浸泡，經(jīng)組織勻漿機(jī)搗碎，超聲20min，8000r/min離心10min，取上清液，在50℃恒溫下氮?dú)饬鲹]至2m，8000r/min離心10min，取上清液，過(guò)Oasis?HLB固相萃取柱（預(yù)先以1mL甲醇，1mL水活化），以1mL 50%甲醇水溶液淋洗雜質(zhì)，棄去，吸取1.0mL甲醇液洗脫測(cè)定物，收集洗脫液，過(guò)0.2μm微孔濾膜，進(jìn)樣10μL供HPLC/MS檢驗(yàn)用。

2 結(jié)果

2.1 甲維鹽原藥與其他類農(nóng)藥相比較的顏色、氣味和PH值

2%甲維鹽為淡黃色，有刺鼻的糖醋味，pH值為5；2%敵敵畏為土黃色，有刺鼻的氯醛味，pH值為2；2%萬(wàn)靈為藍(lán)色，有魚(yú)腥味，pH值為8；2%阿維菌素呈綠褐色，有濃烈的糖醋味，pH值為6。

2.2 濃鹽酸/濃硫酸水解顯色反應(yīng)

2%甲維鹽在濃鹽酸/濃硫酸作用下呈白色凝乳狀且液面漂浮黃色油珠或形成黃色環(huán)狀物。而2%敵敵畏、2%萬(wàn)靈和2%阿維菌素在36%鹽酸/98%硫酸作用下分別呈現(xiàn)土黃色、黃綠色和咖啡色/土黃色、草綠色和紅棕色。

2.3 高錳酸鉀反應(yīng)

甲維鹽為十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲(chóng)劑，其分子中含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，能在30秒以內(nèi)使高錳酸鉀的紫色消褪；而紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物因分子中沒(méi)有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致高錳酸鉀紫色消褪的時(shí)間超過(guò)30秒。

2.4 高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)

2%甲維鹽甲醇溶液（淡黃色），與高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)后變成橘黃色帶有沉淀物的溶液（1h后變成鮮黃色）。提示甲維鹽含有酚羥基，借助此反應(yīng)可與同類殺蟲(chóng)劑阿維菌素等相鑒別（圖1）。

圖1 高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)

2.5 亞硝酸鈉-濃鹽酸反應(yīng)

借助此反應(yīng)主要檢測(cè)甲維鹽分子中的仲胺基，阿維菌素?zé)o此反應(yīng)。仲胺基N上的H，在酸性條件下，可與亞硝基的雙鍵加成變?yōu)镹-亞硝基胺呈黃色。甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與亞硝酸鈉-濃鹽酸反應(yīng)后，溶液呈鮮黃色（圖2）。

圖2 亞硝酸鈉-濃鹽酸反應(yīng)

2.6 紫外分光光度法鑒別

甲維鹽的紫外最大吸收峰為243nm，而紅霉素在此處無(wú)紫外吸收峰。

2.7 薄層色譜法鑒別

甲維鹽為十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類，薄層展開(kāi)后僅用紫外燈（254nm）即可顯出斑點(diǎn)，而紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物在紫外燈下（254nm）沒(méi)有斑點(diǎn)。含有大環(huán)內(nèi)酯類基本母核的化合物遇碘顯示棕黃色。甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液和含有甲維鹽的胃內(nèi)容物凈化上清液樣品，在薄層板上遇碘蒸氣顯示棕黃色斑點(diǎn)。采用三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）展開(kāi)系統(tǒng)時(shí)，樣品的Rf值為0.53，與甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值一致（圖3）。

圖3 甲維鹽的薄層色譜鑒別

2.8 高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）定性

在本色譜和質(zhì)譜條件下，甲維鹽的相對(duì)保留時(shí)間為7.12min。甲維鹽的[M+H]+準(zhǔn)分子離子m/z886.56為母離子，主要碎片離子：m/z868.32，824.31，302.11，242.40。

3 討論

本文建立的甲維鹽系列定性鑒別方法主要包括理化性狀鑒別、4種顯色反應(yīng)鑒別、薄層鑒別和高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）定性鑒別方法，填補(bǔ)了甲維鹽定性鑒別資料匱乏的空白。

甲維鹽屬于大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲(chóng)劑，加濃鹽酸或濃硫酸能使大環(huán)內(nèi)脂類水解呈色，借此能與其他類殺蟲(chóng)劑如有機(jī)磷酸酯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲(chóng)菊酯類和新煙堿類殺蟲(chóng)劑相鑒別。

根據(jù)高錳酸鉀褪色時(shí)間的長(zhǎng)短，可以確定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的母核結(jié)構(gòu)。甲維鹽的母核結(jié)構(gòu)為十六元環(huán)，有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，能在30秒以內(nèi)使高錳酸鉀褪色；而其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物如具有十四元環(huán)母核的紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素和克拉霉素，以及具有十五元環(huán)母核的阿奇霉素，均無(wú)共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，高錳酸鉀褪色時(shí)間需要30秒以上。借此能將甲維鹽等十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲(chóng)劑與這些藥物加以區(qū)分。將浸有高錳酸鉀的試紙條陰干密封配備于法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)勘查箱中可以很便捷地進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)，可用于鑒別酚羥基官能團(tuán)，主要用于檢測(cè)甲維鹽分子中的酚羥基，借助此反應(yīng)可以與同類殺蟲(chóng)劑阿維菌素及其他不含酚羥基的殺蟲(chóng)劑相鑒別。

亞硝酸鈉-濃鹽酸反應(yīng)，主要檢測(cè)甲維鹽分子中的仲胺基。仲胺基N上的H，在酸性條件下，可與亞硝基的雙鍵加成變?yōu)镹-亞硝基胺呈黃色。阿維菌素?zé)o此反應(yīng)，借此可與大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲(chóng)劑中的阿維菌素等同系物加以鑒別。

甲維鹽的紫外最大吸收峰為243nm，而紅霉素在此波長(zhǎng)下無(wú)明顯的紫外吸收峰。薄層展開(kāi)后，甲維鹽在紫外燈（UV254nm）下顯示斑點(diǎn)，而紅霉素沒(méi)有斑點(diǎn)。含有大環(huán)內(nèi)酯類基本母核的化合物遇碘顯示棕黃色。在薄層板上點(diǎn)樣后，采用三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）展開(kāi)，含有甲維鹽和阿維菌素的樣品遇碘蒸氣均呈現(xiàn)棕黃色斑點(diǎn)，通過(guò)與甲維鹽和阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品比對(duì)Rf值很容易鑒別。

采用液-質(zhì)聯(lián)用法，根據(jù)在相同色譜和質(zhì)譜條件下，甲維鹽的相對(duì)保留時(shí)間為7.12min和[M+H]+準(zhǔn)分子離子m/z886.56為母離子，主要碎片離子：m/z868.32，824.31，302.11，242.40，可以很快確定樣品中或生物檢材中的甲維鹽成分。

以上定性方法互相補(bǔ)充，專屬性和特異性較好，非常適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室確證性鑒別。有關(guān)的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查試劑盒正在組裝和試驗(yàn)之中。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典2010版二部[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社.

[2]王霞，丁曉萍．大環(huán)內(nèi)酯類藥物的分析[J]．實(shí)用醫(yī)技雜志，2006，5（12）.

[3]黃彬彬，駱桂紅，童小鈺等．復(fù)凝聚法制備甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微囊[J]．農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（4）.

（責(zé)任編輯：于 萍）

R991

A

2013-12-1

公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2010YYCXXJXY112）。

盧延旭（1958-），男，遼寧沈陽(yáng)人，中國(guó)刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系教授，博士，主要從事法醫(yī)學(xué)研究。