李夢(mèng) 李鳳婷 耿建國(guó)

糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病患者致殘致死的主要原因之一，而細(xì)胞外基質(zhì)(extracellu-lar matrix，ECM)進(jìn)行性積聚是糖尿病腎病發(fā)展過(guò)程中最基本的病理?yè)p傷［1］。生理狀態(tài)下，ECM 產(chǎn)生和降解處于機(jī)體精確調(diào)控下，起到支持、連接組織結(jié)構(gòu)等生理作用。但糖尿病腎病時(shí)，糖代謝紊亂及其所引發(fā)的血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞因子釋放、信號(hào)通路開(kāi)放、組織酶調(diào)節(jié)等多種因素綜合作用使ECM 動(dòng)態(tài)平衡被打破，生成增加而降解減少，導(dǎo)致ECM 進(jìn)行性積聚，進(jìn)而引發(fā)并加劇糖尿病腎?。?-5］。本課題組之前的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)消渴康能夠有效抑制糖尿病腎病時(shí)腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinasse，P38MAPK)表達(dá)從而明顯降低ECM 的產(chǎn)生［6-8］，而自擬消渴康是否也對(duì)ECM 降解產(chǎn)生影響尚不清楚。MMP-9 和TIMP-1 是影響ECM 降解的重要組織酶之一，在糖尿病腎病形成和發(fā)展過(guò)程中，MMP-9 降低與TIMP-1 升高可導(dǎo)致ECM 異常積聚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織MMP-9 與TIMP-1 表達(dá)，從另一方面探討其對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能的保護(hù)作用，現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 雄性大鼠48 只，體重160～180 g，鼠齡2～3月齡，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

1.2 藥物和試劑

消渴康(生黃芪30 g、葛根30 g、決明子10 g、薏苡仁30 g、丹參10 g)湯劑，根據(jù)耿建國(guó)教授臨床經(jīng)驗(yàn)自擬，藥材購(gòu)自北京祥威藥業(yè)公司;氯沙坦甲片，商品名科素亞，購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為“國(guó)藥準(zhǔn)字H20000371”，規(guī)格50 mg/片;鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)，購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;免疫組化試劑盒，購(gòu)自美國(guó)abcam 公司。

1.3 儀器

LEICA 數(shù)字顯微照相機(jī)，NIS-Elements Basic Research 圖像采集分析系統(tǒng)。

1.4 造模

10%水合氯醛(0.35 ml/100 mg)腹腔麻醉后切除右側(cè)腎臟。術(shù)后2 周，腹腔注射STZ(50 mg/kg)。72 小時(shí)后，尾靜脈采血，當(dāng)血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性＞+ + +，確定糖尿病腎病造模成功。

1.5 分組及給藥

將造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、氯沙坦組(5.2 mg/kg·d)、消渴康小劑量組(6.3 g/kg·d)、消渴康中劑量組(12.6 g/kg·d，)，消渴康大劑量組(25.2 g/kg·d)，每組8 只。連續(xù)灌胃12 周，每天1次，正常組、模型組每日灌服等量蒸餾水。

1.6 取材

藥物干預(yù)后第4、8、12 周末，眼眶下靜脈叢取血2 ml。離心取血清，用全自動(dòng)生化儀測(cè)定腎功能。藥物干預(yù)第12 周末，處死大鼠，取出腎臟，去被膜，Bouin 液固定，常規(guī)制片。

1.7 觀察指標(biāo)

免疫組化法檢測(cè)MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)情況，每組采集10 個(gè)40 倍隨機(jī)視野，作積分光密度統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)于各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并作組間兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)分析軟件使用SPSS 13.0。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9、TIMP-1 在腎組織表達(dá)情況

MMP-9 顯色為棕黃色染色顆粒，主要分布在腎小管上皮細(xì)胞中，在腎小球上有散在分布。與正常組比較，模型組MMP-9 顯色明顯減弱，而消渴康小劑量組顯色則明顯加強(qiáng)，見(jiàn)圖1;TIMP-1 顯色為棕黃色染色顆粒，主要分布在腎小管上皮細(xì)胞中，在腎小球上有散在分布。與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組顯色均明顯加強(qiáng)，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組未見(jiàn)明顯加強(qiáng)。與模型組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組顯色明顯減弱，見(jiàn)圖2。

2.2 MMP-9、TIMP-1 積分光密度比較

各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并作組間兩兩比較。MMP-9 結(jié)果比較:與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組、消渴康中劑量組均顯著性降低;與模型組比較，氯沙坦組極顯著性降低(P＜0.05);與氯沙坦組比較，消渴康三劑量組均極顯著性增高(P＜0.01)。TIMP-1 結(jié)果比較:與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組均顯著性增高(P＜0.05);與模型組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組均極顯著性降低(P＜0.01);與氯沙坦組比較，消渴康小劑量組極顯著性降低(P＜0.01)。MMP-9/TIMP-1 結(jié)果比較:與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組均極顯著性降低(P＜0.01);與模型組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組均顯著性升高(P＜0.05);與氯沙坦組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組均顯著性升高(P＜0.05)，具體見(jiàn)表1。

3 討論

腎臟ECM 合成與降解通常處于動(dòng)態(tài)平衡之中。糖尿病腎病時(shí)，高糖作用下ECM 合成與降解的動(dòng)態(tài)失衡是導(dǎo)致腎臟ECM 進(jìn)行性積聚的主要原因［9］。Ⅳ型膠原是ECM 的主要成分，而MMP-9 是Ⅳ型膠原的主要降解酶之一，TIMP-1 是MMP-9 特異性的抑制劑。MMP-9 與TIMP-1 的共同作用對(duì)Ⅳ型膠原的降解起到重要調(diào)節(jié)作用。糖尿病腎病時(shí)，正是由于MMP-9 表達(dá)減少與TIMP-1 表達(dá)增加，導(dǎo)致MMP-9/TIMP-1 下降，從而使得Ⅳ型膠原降解減少，ECM成分穩(wěn)定增高，ECM 合成與降解間動(dòng)態(tài)平衡被打破，最終使糖尿病腎病逐漸向深層次發(fā)展［10-12］。

圖1 腎組織MMP-9 免疫組化染色(40 ×10)

圖2 腎組織TIMP-1 免疫組化染色(40 ×10)

表1 各組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 積分光密度比較(±s)

表1 各組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 積分光密度比較(±s)

注:與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01;與氯沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

組別 n MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1正常組10 6.21±1.63 1.10±0.34 6.03±2.23模型組 10 4.38±0.73b 3.21±2.15b 1.93±1.24b氯沙坦組 10 2.54±0.65bd 2.23±1.34a 1.41±0.65b消渴康大劑量組 10 4.40±1.12bf 2.17±0.81a 2.27±0.9b消渴康中劑量組 10 4.80±1.04af 1.52±0.92d 4.27±2.3ce消渴康小劑量組 10 6.98±1.93df 0.70±0.35df 11.60±4.97 bdf

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)糖尿病腎病正虛邪實(shí)、虛實(shí)互見(jiàn)的病機(jī)特點(diǎn)，采用消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)。其中，葛根與生黃芪同用，益氣養(yǎng)陰、生津止渴、扶助正氣，正氣恢復(fù)則抗邪有力，有利于驅(qū)除邪氣;生薏苡仁、決明子與丹參同用，利濕祛濁、活血祛瘀、攻逐邪氣，邪氣蠲除則消除邪氣對(duì)正氣的危害，有利于正氣的恢復(fù)。諸藥合用，扶正祛邪，具有益氣養(yǎng)陰、利濕化濁、活血化瘀的作用，與糖尿病腎病病機(jī)十分符合。

本課題組先前的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)消渴康能夠有效抑制糖尿病腎病時(shí)腎組織TGF-β1、P38MAPK表達(dá)，從而抑制ECM 的生成，有效的保護(hù)了腎臟微觀結(jié)構(gòu)，改善腎功能異常。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果又證實(shí)消渴康能夠顯著提高糖尿病腎病大鼠腎組織MMP-9表達(dá)(消渴康小劑量組，P＜0.01)，降低TIMP-1 表達(dá)(消渴康小劑量組、消渴康中劑量組，P＜0.01)，有效加強(qiáng)ECM 降解，從而抑制ECM 在腎臟積聚。由此可見(jiàn)，消渴康對(duì)于糖尿病腎病的保護(hù)作用很可能是通過(guò)有效抑制腎臟ECM 異常積聚、維護(hù)腎臟微觀結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的，而消渴康對(duì)ECM 異常積聚的抑制作用不僅表現(xiàn)在降低ECM 合成，同樣表現(xiàn)在增強(qiáng)ECM 降解上，從而具有較好的抑制ECM 積聚作用，最終起到保護(hù)糖尿病腎病腎臟功能、延緩糖尿病腎病發(fā)展的作用，為后期臨床研究提供了一定的參考依據(jù)。

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