魏福軍，張建，王天華田，田賈世友，伊莎莎，郭玉秋

（1. 大慶市公安（局南刑京事航技空術(shù)航支天隊大，學黑 龍生江物大醫(yī)慶學 工16程33系11，；江2. 蘇公省安 部南物京證市鑒 21定00中16心），北京 100038）

近些年來， DNA數(shù)據(jù)庫的建設(shè)和應用，極大提升了公安機關(guān)打擊犯罪的效能。DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)業(yè)已成為目前法庭科學領(lǐng)域發(fā)展的重中之重，DNA數(shù)據(jù)庫的規(guī)模及內(nèi)存容量也在逐年擴大[1,2]。當前，DNA數(shù)據(jù)庫樣本的檢驗主要包括樣本采集、樣本直接擴增、DNA檢測三個主要步驟。樣本采集主要是指各地公安機關(guān)對違法犯罪人員及相關(guān)涉案人員進行身份信息和相應生物樣本采集。傳統(tǒng)數(shù)據(jù)庫樣本主要以血卡為主，針對該類樣本，各DNA實驗室均已建立的成熟的DNA檢驗流程，檢驗成功率高、檢驗速度快。與此同時，近年來口腔細胞樣本采集卡由于具備使用方法簡單、被采集者無創(chuàng)無痛等特點，能夠避免基層民警取樣帶來不必要的糾紛，因此，在有些地區(qū)口腔細胞樣本采集卡正逐漸替代傳統(tǒng)的血樣采集。然而，該類樣本的檢驗也存在一系列問題：第一，無法準確定位口腔細胞采集卡上口腔細胞的位置；第二，口腔細胞在采集卡上分布不均，存在著取樣時取不到細胞造成初檢成功率低的情況[3,4]。有鑒于此，目前口腔細胞的檢驗仍是一個比較棘手的問題，針對該類樣本的檢測主要還是以DNA自動化提取后再進行擴增檢測的方法為主，這種方式費時、費力、同時耗費大量辦案經(jīng)費。本研究通過采用小孔徑生物樣本自動打孔儀多點取樣的方式，結(jié)合DNATyperTM19試劑盒對口腔細胞樣本進行直接擴增，初檢成功率達到98%，極大提高了口腔細胞卡類樣本的批量檢驗效率，解決了困擾法庭科學DNA實驗室的口腔卡類數(shù)據(jù)庫樣本的檢驗難題。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

本實驗室日常積累的違法犯罪人員口腔細胞采集卡樣本（博坤公司研制）200份。

1.2 主要試劑

DNATyperTM19試劑盒（公安部物證鑒定中心，中國）。

1.3 主要儀器

BSD600型半自動打孔儀（BSD公司）、BIOMEK-NXP、BIOMEK-3000自動化工作站2臺（貝克曼公司）、9700型擴增儀（AB公司）、3130XL型基因分析儀（AB公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1PCR反應液分裝

按照DNATyperTM19試劑盒說明書配制PCR擴增試劑，利用BIOMEK-NXP自動化工作站將按每孔10μL試劑加入到96孔擴增板中。

1.3.2口腔細胞采集卡樣本取樣

設(shè)置BSD600型半自動打孔儀運行參數(shù)，使之在口腔細胞采集卡樣本上打孔取樣，選擇靠近棉簽轉(zhuǎn)印區(qū)的部位，打下2至3片1.0mm的樣本，置于已加入反應液的96孔擴增板中離心，待打取的樣本完全浸入擴增試劑后擴增。

1.3.3擴增反應

95℃11分鐘；94℃30秒，59℃2分鐘，72℃1分鐘，28個循環(huán)；60℃60分鐘，25℃保存。

1.3.4電泳前加樣

使用 BIOMEK-3000自動化工作站對擴增后產(chǎn)物按照PCR擴增產(chǎn)物1μL與9μL上樣混合物比例混合后進行加樣電泳。

1.3.5電泳檢測及STR分型

通過3 1 3 0 X L型遺傳分析儀電泳分離后，采用GeneMaperID v3.2分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

通過采用生物樣本自動打孔儀小孔徑多點取樣的方式，結(jié)合DNATyperTM19試劑盒對200份違法人員口腔細胞樣本進行批量化直接擴增檢驗，其中196份樣本得到了完整的STR分型，初檢成功率高達98%（部分樣本分型見圖1），檢驗結(jié)果準確，無pull-up峰、非特異性人工產(chǎn)物等現(xiàn)象出現(xiàn)。此外，未獲完整分型的4個樣本，再次使用相同的檢驗方式后獲得完整分型（數(shù)據(jù)未列出）。

2.2 討論

圖1部分口腔細胞采集卡樣本的STR分型結(jié)果Fig.1Example of STR genotyping of buccal cell samples

張建等的研究表明，市售的口腔細胞采集卡含有熒光成分，直接擴增檢驗過程中，樣本量過大會對樣本的部分分型有熒光干擾[5]。本研究基于已有研究數(shù)據(jù)和本實驗室的建庫檢驗經(jīng)驗，采用生物樣本自動打孔儀小孔徑多點取樣的方式結(jié)合應用DNATyperTM19試劑盒對口腔細胞采集卡樣本進行直接擴增檢驗，避免了DNA提取等操作，極大簡化了檢驗流程，節(jié)約檢驗時間和成本，且具備98%以上的初檢成功率。BSD600型半自動打孔儀能夠同時打出兩片相同或不同尺寸的圓紙片，具有的光定位設(shè)備可以自動根據(jù)選擇的打子孔數(shù)量及孔徑準確定位，大幅增加通量，縮短工作時間。使用打孔儀的小孔徑取樣，避免了取樣量過大造成的擴增干擾物的影響；多點取樣的操作，增加了取準細胞的幾率，提高了初檢成功率（本研究中未獲完整分型的4個樣本，復檢后獲得完整分型，也從另一個方面證明了這一觀點）。另外，本實驗室使用的DNATyperTM19試劑盒可以同時擴增和檢測18個STR基因座以及Amelogenin性別基因座，完全滿足國家DNA數(shù)據(jù)庫對位點數(shù)的要求[6～8]，本文研究建立的口腔細胞采集卡DNA分型快速檢驗模式能夠?qū)崿F(xiàn)檢驗我省普遍應用的口腔細胞采集卡的高效、快速檢驗，方法簡便易行，進而節(jié)約了建庫成本，對我省DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)和法治建設(shè)有重大的現(xiàn)實意義。

[1] 趙興春, 葉健. 法庭DNA技術(shù)的發(fā)展及展望. 刑事技術(shù), 1998(5):42- 46.

[2] 葛百川, 郭紅玲, 王穗保. 美國、加拿大DNA數(shù)據(jù)庫概況及我國建立DNA數(shù)據(jù)庫的思考. 刑事技術(shù), 2001(4): 7-9.

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[4] Dennis Y W, Chien W C, Lori K H. Rapid STR analysis of single source DNA samples in 2h. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2009, 2( 1) : 115- 116.

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[6] 趙興春, 姜成濤, 葉健, 等. DNATyperTM15試劑盒的法醫(yī)學應用研究.中國法醫(yī)學雜志, 2008, 23(3): 169-171.

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[8] 鄭秀芬. 法醫(yī)DNA 分析. 北京: 中國人民公安大學出版, 2002:385-387.