晉晨晨，李 瑾，馬 瀾，陳毅華，郭波紅

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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葛根素及其納米混懸劑平衡溶解度測定

晉晨晨，李 瑾，馬 瀾，陳毅華，郭波紅*

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：測定葛根素及其納米混懸劑在 pH1.2 鹽酸溶液、水、pH7.4 PBS 緩沖液介質(zhì)中的平衡溶解度。方法：采用高效液相色譜法(HPLC)測定葛根素及其納米混懸劑在各個介質(zhì)中的濃度。結(jié)果：在37℃下，葛根素納米混懸劑在 pH1.2 鹽酸溶液、水、pH7.4磷酸鹽(PBS)緩沖液中的平衡溶解度分別為4.43、5.28、6.32mg·mL-1。結(jié)論：葛根素納米混懸劑比原料藥在各介質(zhì)的溶解度均增加，在弱堿性介質(zhì)中溶解度大于酸性介質(zhì)，隨pH升高而增大。葛根素水溶性較差，將其制備成納米混懸劑有利于提高其溶解度。

葛根素；納米混懸劑；平衡溶解度；高效液相色譜

葛根素化學(xué)名為8-β-D葡萄糖基-7,4′-二羥基異黃酮(8-β-D-Glucopyranosy-7,4′-hydroxyisoflavone)，可從豆科植物野葛的干燥根中提取得到，呈白色針狀結(jié)晶[1]。具有擴張冠狀動脈、降血壓、降血脂、保護心肌及抗氧化、抗血栓形成、改善微循環(huán)等多種藥理活性。作為改善心腦血管循環(huán)的新藥，葛根素因毒性小、安全范圍廣、療效好而極具臨床應(yīng)用價值，因此臨床上常將其注射液用于冠心病、高血壓、腦梗死、椎-基底動脈供血不足、糖尿病、突發(fā)性耳聾、青光眼等疾病的治療。但用其注射在臨床上易引起過敏性休克、急性溶血等不良反應(yīng)[2]，而葛根素在水中的溶解度較低，僅為 0.011mol/L ，因此口服吸收差，體內(nèi)的生物利用度低[3]。為了改善其水溶性，提高藥物的生物利用度，可將其制備成納米混懸劑[4-5]。葛根素納米混懸劑通過減小藥物粒子的粒徑以增大其溶解度[6]，使藥物溶出速度增加, 從而提高口服給藥的生物利用度。

為了測定葛根素納米混懸劑在不同介質(zhì)中的溶解度，本實驗采用搖床法，建立專屬性強的高效液相分析方法，并進行相應(yīng)的方法學(xué)驗證。通過測定葛根素納米混懸劑在不同介質(zhì)中的溶解度，為改善葛根素的生物利用度研究提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

10AVP 高效液相色譜儀(日本島津株式會社)；PKZ-1電熱恒溫振蕩水浴振蕩儀( 上海精密實驗設(shè)備有限公司)；JA1003N 精密電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

1.2 試藥

葛根素(purity≥99%，上海諾特生物科技有限公司)；葛根素納米混懸劑(實驗室自制)；PVP K30(美國ISP公司)；HPLC Grade色譜甲醇(美國迪馬公司)；檸檬酸(天津市百世化工有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與方法專屬性試驗

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm ，5μm)；流動相：甲醇-體積分?jǐn)?shù)為1%枸櫞酸水溶液(體積比25∶75)；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1；紫外檢測波長：250nm；進樣量：10μL。精密量取葛根素對照品溶液，供試品溶液及陰性溶液各10μL ，在上述色譜條件下注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。實驗結(jié)果表明，葛根素的保留時間為16.70min，峰對稱性良好，理論塔板數(shù)不低于7 000。供試品中的輔料對主成分無干擾,見圖1。

圖1 陰性樣品(A)/葛根素(B)和納米混懸劑(C)色譜

2.2 對照品溶液制備

精密稱取葛根素對照品10mg，置于25mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.4mg·mL-1的對照品儲備液。精密量取該儲備液1mL，置于10mL容量瓶中,流動相稀釋至刻度, 搖勻, 即得對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密量取葛根素納米混懸劑溶液 500μL于 10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻。精密量取2.0mL，置于10mL 容量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻, 即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

取空白納米混懸劑(不加入主藥)，按“2.3”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取對照品儲備液適量，置10mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混勻，制得質(zhì)量濃度分別為 5、10、20、40、80、100μg·mL-1的對照溶液。分別進樣10μL，依法進行測定，記錄峰面積(A)。以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C，μg·mL-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程為A=40512C-39623 , r=0.9998。結(jié)果表明在5～100μg·mL-1范圍內(nèi)，葛根素的質(zhì)量濃度和峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

照“2.1”項下的色譜條件，取質(zhì)量濃度為 40μg·mL-1的對照品溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以上同批同1天內(nèi)連續(xù)平行6次，根據(jù)主峰峰面積，計算出日內(nèi)RSD為 0.82 % (n=6)；另取同一對照品溶液連續(xù)6天每日平行1次，根據(jù)主峰峰面積，計算出日間RSD為 1.30 %(n=6)。

2.7 重復(fù)性試驗

照“2.3”項下供試品溶液的制備方法配制供試品溶液，照“2.1”項下的色譜條件，取上述供試品溶液進樣6次平行測定，得主成分含量的RSD為0.71%(n=6)。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，在室溫下靜置，并在0、2、4、8、12、24h分別取樣10μL，經(jīng)HPLC分析，計算得各時間點峰面積(A)的平均值為0h時測定值的100.2%、100.3%、100.1%、99.7%、100.2%。實驗表明該溶液在常溫下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 定量限的確定

取葛根素對照品溶液，加甲醇水溶液逐級稀釋，進行HPLC分析，測得定量限( S/N=10)為32ng。

2.10 回收率試驗

精密量取1.0mL的空白納米混懸劑9份，分別置于10mL量瓶中，精密加入0.4mg·mL-1對照品儲備液 0.25、1.0、2.5mL各3份，并用流動相稀釋至刻度，混勻。分別進樣10μL，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果表明高、中、低3個水平的回收率分別為99.4%( RSD 為 1.2%，n=3 )、98.7%(RSD為1.3%，n=3)、100.2%(RSD為1.1%，n=3)，平均回收率為99.43%( n=9)。

2.11 平衡溶解度測定

稱取過量葛根素原料藥及葛根素噴霧干燥納米混懸劑粉末置于25mL 具塞三角瓶中, 加入10mL 蒸餾水，超聲處理使粉末充分分散后，置37℃恒溫水浴振蕩儀中振蕩24h后取出[7-8]，用 0.45μm微孔濾膜過濾。分別精密吸取濾液，用流動相適當(dāng)稀釋后，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按照公式計算可得飽和溶解度(C)。另外以相同的條件在pH1.2鹽酸溶液、 pH7.4 PBS 緩沖液中分別測定葛根素原料藥及其納米混懸劑的飽和溶解度。平行做3份，結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，原料藥在 pH1.2 鹽酸溶液、水、pH7.4 PBS 緩沖液中的飽和溶解度分別為 2.05mg·mL-1、2.78mg·mL-1、3.02mg·mL-1，納米混懸劑的飽和溶解度分別為 4.43mg·mL-1、5.28mg·mL-1、6.32mg·mL-1。說明將葛根素制備為納米混懸劑可以顯著提高其溶解度。

圖2 37℃下不同pH介質(zhì)中葛根素及其納米

3 討論

本實驗制備葛根素納米混懸劑方法簡單，并且輔料對測定無干擾作用。采用高效液相方法，樣品各項指標(biāo)均達到藥物分析研究的方法學(xué)要求，重現(xiàn)性好，是一種高效、靈敏、專一、簡便的測定方法。

根據(jù)溶解度的測定結(jié)果，制成葛根素納米混懸劑后，其溶解度是原料藥的2倍。制成納米混懸劑，可以使其粒徑減小，實驗已測得葛根素原料藥的粒徑為3μm，而其納米混懸劑的粒徑為195nm (另文發(fā)表)，粒徑顯著減小。根據(jù)Ostwald-Freundlich 方程 (公式1)，難溶性藥物粒子大小會影響溶解度[6]，藥物粒子越小，其溶解度越大，故將葛根素制成納米混懸劑能夠顯著提高溶解度，從而提高其溶出速率。

(1)

S1、S2分別是半徑為r1、r2的藥物溶解度，σ為固體藥物與液態(tài)溶劑之間的界面張力，M為藥物的分子量，ρ為固體藥物的密度，R為氣體常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度。

在納米混懸劑中，常采用加入表面活性劑或高分子聚合物作為穩(wěn)定劑來抑制藥物粒子間的聚集沉積[3]。本實驗采用PVP K30作為載體，可制備穩(wěn)定的葛根素納米混懸劑。這可能由于其表面活性作用，PVP K30與葛根素結(jié)合后可降低藥物顆粒的表面張力，在葛根素粒子表面形成致密界面，減少內(nèi)部藥物分子向水相擴散，從而抑制粒子聚集。PVP分子在水中溶脹伸展，具有一定空間穩(wěn)定作用，可有效抑制葛根素藥物粒子間的聚集沉積，保證葛根素納米混懸劑具有較好的穩(wěn)定性。

通過在不同pH介質(zhì)中的溶解度比較，可以看出隨著pH的增大，其溶解度也增大。人體正常的生理環(huán)境pH大致為3.0～8.0，所以通常采用pH1.2鹽酸、水和pH7.4 PBS緩沖液來進行溶解度的實驗。本實驗中葛根素在堿性介質(zhì)中的溶解度大于其在酸性介質(zhì)中的溶解度，其可能的原因是葛根素為7,4′-二羥基異黃酮，顯酸性，在弱堿性的介質(zhì)中形成復(fù)合物或鹽增大其溶解度；也可能是羥基在堿性介質(zhì)中解離使其水溶性增大。

[1] 王靖，吉民，華維一，等.葛根素研究進展[J]. 藥學(xué)進展，2003, 27(2)：70-73.

[2] 劉紹德, 莫惠平. 葛根素注射液的不良反應(yīng)及預(yù)防[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005, 25(9)：852-855.

[3] 王展，韓立煒，任天池. 葛根素-聚乙二醇6000固體分散體的制備及其溶解性能的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，30(5): 346-349.

[4] LUO C F，YUAN M, CHEN M S, et al. Pharmacokinetics, tissue distribution and relative bioavailability of puerarin solid lipid nanoparticles following oral administration[J]. Int J Pharm,2011,410:138-144.

[5] WANG Y C, MA Y, MA Y Y, et al. Formulation and pharmacokinetics evaluation of puerarin nanocrystals for intravenous delivery[J].J Nanosci Nanotechnol,2012,12:6176-6184.

[6] MAULUDIN R,MULLER R H,KECK C M,et al. Kinetic solubility and dissolution velocity of rutin nanocrystals[J]. Eur J Pharm Sci,2009,36(4-5):10-502.

[7] 王曉蕾，孫藝丹，王銳利，等. 蒿甲醚在不同介質(zhì)中的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)的測定[J]. 藥物評價研究，2013，36(2): 114-118.

[8] 熊耀坤，梁爽，杜焰，等. HPLC法測定洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)[J]. 藥物分析雜志，2012，32(9)：1644-1647.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Determination of Equilibrium Solubility of Puerarin and Puerarin Nanosuspension in Various Media

Jin Chenchen, Li Jin, Ma Lan, Chen Yihua，Guo Bohong

(School of pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Objective:To determine the equilibrium solubility of puerarin and its nanosuspension in various media, such as pH1.2 acid solution, water, and pH7.4 PBS buffer.Methods:High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the concentration of puerarin nanosuspension in different media.Results:The equilibrium solubility of puerarin nanosuspension in pH1.2 acid solution, water, and pH7.4 PBS buffer at 37 ℃ was 4.43, 5.28 and 6.32mg·mL-1, respectively. Conclusion:The equilibrium solubility of puerarin nanosuspension is higher than the equilibrium solubility of puerarin，in alkaline phosphate buffer than in others and is higher with the increase of pH. Water solubility of puerarin is poor, puerarin nanosuspension may have the possibility to enhance its dissolution rate.

Puerarin; Nanosuspension; Equilibrium Solubility; High Performance Liquid Chromatography

2014-02-03

晉晨晨(1992-)，女，廣東藥學(xué)院在讀生。

郭波紅(1976-)，女，廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院副教授，研究方向為藥物新劑型與新技術(shù)。

R283.6

A

1673-2197(2014)11-0041-03