張西軒　李曄　阮海華

摘要 [目的]構(gòu)建人泛素結(jié)合酶UbcH5c的活性位點突變體S22R和F62A，同時分析這2種突變體蛋白與野生型蛋白在泛素化反應(yīng)中的活性差異。[方法]通過點突變（Site-Directed Mutagenesis）的方法構(gòu)建2種突變體質(zhì)粒，利用0.5 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)2種突變體蛋白在大腸桿菌中進行表達；將菌體超聲破碎后，依次利用陽離子交換層析法對UbcH5c突變蛋白進行分離純化，最后利用體外泛素化酶促反應(yīng)結(jié)合蛋白免疫印跡雜交的方法分析野生型UbcH5c與其活性突變體UbcH5c S22R和UbcH5c F62A在泛素化修飾上的差異。[結(jié)果]人泛素結(jié)合酶UbcH5c的2個突變體蛋白S22R、F62A的泛素化修飾程度明顯弱于野生型蛋白。[結(jié)論]突變體S22R和F62A突變均不同程度的改變了人泛素結(jié)合酶UbcH5c與泛素分子之間的結(jié)合活性，即2個突變的位點中第62位苯丙氨酸殘基及第22位絲氨酸殘基均是UbcH5c結(jié)合泛素的關(guān)鍵位點，而且后者對于UbcH5c結(jié)合泛素活性的影響更大。

關(guān)鍵詞 UbcH5c；泛素化修飾；點突變

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）03-00663-04

蛋白的泛素化修飾包括以下3個步驟：（1）泛素的活化：泛素甘氨酸端的羧基連接到泛素活化酶E1（Ubiquitin activating enzyme）的巰基，這個步驟需要以ATP作為能量，最終形成一個泛素和泛素活化酶E1之間的硫酯鍵；（2）E1將活化后的泛素通過交酯化過程交給泛素結(jié)合酶E2（Ubiquitin conjugating enzyme）；（3）泛素連接酶E3將結(jié)合在E2上的泛素分子連接到底物蛋白上，最終，底物蛋白被泛素化修飾[1-3]。UbcH5c是泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）家族中的成員，由147個氨基酸構(gòu)成，分子量約為16 kDa[4]。在泛素介導(dǎo)的泛素化反應(yīng)途徑中泛素活化酶（E1）將活化后的泛素分子通過交酯化過程呈遞給UbcH5c，泛素分子結(jié)合于UbcH5c的第85位半胱氨酸（Cys85）形成UbcH5c-Ub復(fù)合物，其中Cys85是UbcH5c的活性催化中心的氨基酸[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在泛素化級聯(lián)反應(yīng)中，除了UbcH5c通過巰酯鍵與泛素分子之間形成復(fù)合物以外，其他的氨基酸在該復(fù)合物的形成過程中也發(fā)揮重要作用，例如第22位的絲氨酸（Ser，S）和第62位的苯丙氨酸[6]。筆者通過點突變（Site-Directed Mutagenesis）的方法分別構(gòu)建2種UbcH5c的活性突變體UbcH5c S22R、UbcH5c F62A；其中，UbcH5c S22R為野生型UbcH5c的氨基酸序列上第22位的絲氨酸（Ser，S）改變?yōu)榫彼幔ˋrg，R）；UbcH5c F62A為野生型UbcH5c的氨基酸序列上第62位的苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)）改變?yōu)楸彼幔ˋla，A）；并利用體外泛素化酶促反應(yīng)與蛋白免疫印跡的方法分析野生型UbcH5c及其2個突變體在泛素化反應(yīng)中活性的差異，以期為UbcH5c活性突變體的的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒載體。感受態(tài)大腸桿菌E.coli Trans10、E.coli BL21（DE3）、重組質(zhì)粒pET21a-UbcH5c，由實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。Vent DNA polymeras，購自美國NEB公司；T4 DNA連接酶，購自美國 Promega公司；PVDF膜，購自德國Milipore公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒，購自北京天根公司；鼠源UbcH5c單克隆抗體，購自Abcam公司；鼠源HRP偶聯(lián)抗體，購自Promega公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒，購自Thermo Scientific；其他試劑為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 人泛素結(jié)合酶UbcH5c點突變體的構(gòu)建。人泛素結(jié)合酶UbcH5c突變體的構(gòu)建采用Site-directed Mutagenesis Kit 的方法，即根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的人泛素結(jié)合酶UbcH5c的基因編碼序列（GenBank號為U39318.1）分別設(shè)計2對互補的引物（如表1所示）構(gòu)建突變體質(zhì)粒[5]。質(zhì)粒構(gòu)建采用PCR的方法，反應(yīng)條件為 94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，78 ℃，30 s，72 ℃，10 min，16個循環(huán)；72 ℃，15 min。取20 μl PCR產(chǎn)物利用DpnI于37 ℃下酶切1 h，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增成功，再將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans 10 感受態(tài)細胞中，涂布于含Ampr的LB平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落接種于含Ampr的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后進行測序驗證。

2.4 人泛素結(jié)合酶UbcH5c及其2種突變體UbcH5c S22R、UbcH5c F62A泛素結(jié)合活性分析 圖6表明，野生型UbcH5c具有最強的泛素結(jié)合活性，其UbcH5c-Ub復(fù)合物的生成量最多。相比之下，突變體UbcH5c S22R的泛素結(jié)合活性明顯弱于野生型UbcH5c，且生成的UbcH5c-Ub復(fù)合物也偏少。而突變體UbcH5c F62A的泛素結(jié)合活性幾乎完全喪失，不能夠與泛素分子之間形成UbcH5c-Ub復(fù)合物。結(jié)果表明，人泛素結(jié)合酶UbcH5c中第22位的絲氨酸與第62位的苯丙氨酸的單獨突變均明顯削弱了UbcH5c與泛素分子的結(jié)合活性；且與第22位的絲氨酸相比，第62位的苯丙氨酸位點對于其與泛素分子結(jié)合至關(guān)重要。

3 結(jié)論與討論

試驗利用定點突變的方法構(gòu)建了人泛素結(jié)合酶UbcH5c的2株突變體蛋白，分別為S22R和F62A。通過與野生型蛋白進行比較發(fā)現(xiàn)，S22以及F62的突變直接導(dǎo)致UbcH5c與泛素分子之間非共價結(jié)合作用明顯降低，表明這2個位點與UbcH5c和泛素分子之間非共價結(jié)合直接相關(guān)。泛素結(jié)合酶是泛素化修飾途徑中的核心組件之一，且可以將活化的泛素分子從泛素活化酶上轉(zhuǎn)移到特定的泛素連接酶上[7-9]。研究表明，人泛素結(jié)合酶UbcH5c與泛素的結(jié)合包括2種方式，一種為其第85位的半胱氨酸與泛素分子的共價結(jié)合，另一種為其與泛素分子的非共價結(jié)合。人泛素結(jié)合酶UbcH5c與泛素分子的非共價結(jié)合對泛素的成鏈具有重要作用，為了研究人泛素結(jié)合酶UbcH5c與泛素分子之間的非共價結(jié)合。Brzovic等在蛋白質(zhì)的分子水平上，利用核磁共振成像等手段對人泛素結(jié)合酶UbcH5c與泛素通過非共價結(jié)合形成的復(fù)合物進行了研究[6]。結(jié)果表明，人泛素結(jié)合酶UbcH5c可以識別并非共價的結(jié)合泛素分子上第8位的亮氨酸、第44位的異亮氨酸以及第70位的纈氨酸，這種與泛素分子之間非共價的結(jié)合主要集中在人泛素結(jié)合酶UbcH5c上遠離其半胱氨酸（Cys85）殘基的β折疊鏈1-3上，其中距離最近的非共價結(jié)合位點也超過了20個氨基酸的長度，且一個泛素分子不能同UbcH5c Cys85殘基以及非共價結(jié)合位點同時結(jié)合。當(dāng)UbcH5c的非共價結(jié)合位點S22與F62被突變后，人泛素結(jié)合酶UbcH5c的泛素化修飾程度變得異常微弱與緩慢。

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