王穎等

摘要 在長期的進(jìn)化過程中，針葉樹逐步發(fā)展形成了由原生性防御和誘導(dǎo)性防御共同組成的防御體系，在抵抗機(jī)械損傷、病原菌侵染和植食性昆蟲取食的過程中發(fā)揮了重要的作用。誘導(dǎo)性防御又分為結(jié)構(gòu)防御和化學(xué)防御。文章分別從針葉樹的周皮、韌皮部、木質(zhì)部等組織結(jié)構(gòu)的變化，萜烯類、酚類等化學(xué)防御物質(zhì)的合成代謝等方面，描述了誘導(dǎo)性防御反應(yīng)的特點(diǎn)和作用形式，總結(jié)了針葉樹防御反應(yīng)分子機(jī)制研究的最新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 針葉樹；誘導(dǎo)防御；萜烯；萜烯合成酶

中圖分類號 S763.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）03-00810-04

Abstract In the long term evolution， conifers have developed an advanced defense system consists of preformed defenses and induced defenses， which plays an important role in responses to mechanical damage， pathogen infection and insect herbivores. Induced defenses are of two basic types： constitutive defenses and chemical defenses. This review focus on the features and manifestations of induced defenses， described respectively anatomical changes in periderm， phloem and xylem， the biosynthesis of terpenoids and phenolics， and summarized latest progress of induced defenses molecular mechanism research.

Key words Conifers； Induced defenses； Terpenoids； Terpenoids synthase

針葉樹是已知的在地球上存活最為久遠(yuǎn)的一類植物，它生長周期長，分布廣泛，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。在長期協(xié)同進(jìn)化的過程中，針葉樹發(fā)展形成了一套龐大而復(fù)雜的防御體系，用以抵抗生物入侵、殺菌和密封傷口。現(xiàn)代研究表明，針葉樹的防御體系主要分為2種：即原生性防御（preformed defenses）和誘導(dǎo)性防御（induced defenses）。原生性防御是預(yù)先形成的基本防御系統(tǒng)，在樹木受到侵染前就已經(jīng)存在；誘導(dǎo)性防御是寄主樹木的一個(gè)主動(dòng)調(diào)節(jié)的行為，是原生性防御反應(yīng)的繼續(xù)和發(fā)展，指植物在受到外物入侵傷害之后，通過啟動(dòng)和激活某些基因，調(diào)控體內(nèi)一系列的生理生化變化而產(chǎn)生的抗性反應(yīng)。誘導(dǎo)性防御反應(yīng)又分為結(jié)構(gòu)防御（constitutive defenses）和化學(xué)防御（chemical defenses），誘導(dǎo)性結(jié)構(gòu)防御指樹木組織結(jié)構(gòu)的改變、受傷部位的組織修復(fù)；誘導(dǎo)性化學(xué)防御主要是指次生代謝產(chǎn)物的重新合成以及群落間的化學(xué)通訊。這2種防御在發(fā)生時(shí)間上和防御機(jī)制上均不相同，但作為針葉樹防御系統(tǒng)的重要組成部分，兩者相互聯(lián)系，相互協(xié)調(diào)，共同承擔(dān)了寄主樹木的防御任務(wù)。研究樹木的防御反應(yīng)，有利于在理論上進(jìn)一步闡明寄主樹木與昆蟲、病原菌、環(huán)境之間的互作關(guān)系，對于抗性育種和病害蟲的綜合治理具有重要的指導(dǎo)意義，筆者將對針葉樹的誘導(dǎo)性防御體系研究進(jìn)行總結(jié)綜述。

1 誘導(dǎo)性結(jié)構(gòu)防御

1.1 創(chuàng)傷周皮 樹體的周皮和皮層共同形成了一道通透性的屏障，同時(shí)也是阻擋一切生物和非生物傷害的第一道防線[1]。周皮由木栓形成層、木栓和栓內(nèi)層構(gòu)成。周皮部位的細(xì)胞大部分已經(jīng)死亡，細(xì)胞壁變得木質(zhì)化或栓化，這些特征使得周皮變得堅(jiān)硬，但它并不是一個(gè)密閉的結(jié)構(gòu)，周皮表面有許多的氣孔，控制著莖干內(nèi)外部的氣體交換，因此，開放的氣孔成了外來有害生物潛在的侵入位點(diǎn)。中穴星坑小蠹（Pityogenes chalcographus）和體型更大一點(diǎn)的六齒小蠹（Ips acuminatus）都可以由氣孔進(jìn)入到挪威云杉內(nèi)部[2]。針葉樹木在皮層受到創(chuàng)傷后能夠引起受傷部位的組織壞死，與創(chuàng)傷位點(diǎn)相連的第一層細(xì)胞形成一個(gè)封閉層，在封閉層下方迅速形成新的次生保護(hù)組織——?jiǎng)?chuàng)傷周皮，直接影響了害蟲的侵入行為及對侵入部位的選擇。

1.2 次生韌皮部 針葉樹的次生韌皮部是進(jìn)行防御反應(yīng)的主要部位，多酚薄壁細(xì)胞廣泛存在于韌皮部組織中，它是分泌和儲存酚類物質(zhì)的場所，當(dāng)多酚薄壁細(xì)胞被破壞時(shí)，細(xì)胞及時(shí)釋放具有殺滅真菌和抑蟲作用的酚類物質(zhì)，是一種重要的初級防御策略[3-5]。多酚薄壁細(xì)胞的防御應(yīng)答體現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞數(shù)量增加2個(gè)方面。挪威云杉在感染長喙殼屬（Ceratocystis polonica）真菌后，多酚薄壁細(xì)胞液泡內(nèi)的可溶性酚類物質(zhì)明顯增多，細(xì)胞體積膨脹[6-7]。當(dāng)傷害嚴(yán)重或持久時(shí)，多酚薄壁細(xì)胞層內(nèi)側(cè)可分化出新的多酚薄壁細(xì)胞[7-8]。

1.3 木質(zhì)部 樹脂道系統(tǒng)是針葉樹的基本特征，橫向樹脂道和縱向樹脂道交錯(cuò)排列，形成一個(gè)立體的樹脂管道系統(tǒng)。創(chuàng)傷樹脂道（TRD）的形成發(fā)生在木質(zhì)部，是由形成層細(xì)胞分化而成的軸向樹脂道，截面呈環(huán)狀排列[9]。創(chuàng)傷樹脂道的形成屬于一種滯后防御機(jī)制，發(fā)生時(shí)間較晚，通常需要2～8周。如挪威云杉在創(chuàng)傷后的第8天便開始分化創(chuàng)傷性樹脂道的上皮細(xì)胞，直到創(chuàng)傷后第36天才形成成熟的創(chuàng)傷樹脂道[10]。創(chuàng)傷樹脂道和原有的樹脂道一樣，都具有分泌和儲存樹脂的功能，是樹木獲得系統(tǒng)抗性的標(biāo)志[3]。

1.4 細(xì)胞程序化死亡 細(xì)胞程序化死亡（PCD），又稱過敏反應(yīng)，是多細(xì)胞有機(jī)體生命周期中正常的組成部分，是一種受基因調(diào)控的生理性細(xì)胞死亡。植物可以對特定的病原物進(jìn)行識別，體內(nèi)健康細(xì)胞在胞外信號的誘導(dǎo)下，激活死亡途徑，導(dǎo)致局部組織壞死，從而限制病原物在侵染點(diǎn)的擴(kuò)散。當(dāng)外物停止入侵以后，壞死的組織會自動(dòng)與健康樹體組織分離脫落。細(xì)胞程序化死亡是高等生物長期進(jìn)化的結(jié)果，是一種短期防御策略。

針葉樹木的細(xì)胞程序化死亡現(xiàn)象可以發(fā)生在所有的受傷位點(diǎn)，包括皮層、韌皮部和木質(zhì)部。組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)等綜合研究表明，樹木的細(xì)胞程序化死亡主要是由害蟲取食或機(jī)械損傷所引起的，受真菌本身的誘導(dǎo)非常有限[11-12]，但昆蟲的伴生菌能刺激并放大這一過程[13]。如山松大小蠹伴生真菌加劇了美國黑松受傷部位細(xì)胞的程序化死亡[14]。

2 誘導(dǎo)性化學(xué)防御

植物與動(dòng)物不同，不能主動(dòng)躲避危害，因此，合成和釋放化學(xué)物質(zhì)成為植物的主要防御手段。針葉樹的化學(xué)防御物質(zhì)包括萜烯類化合物和酚類化合物，分別由類異戊二烯途徑和苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生。

2.1 萜烯類化合物 松脂是針葉樹重要的防御物質(zhì)，由樹脂道的泌脂細(xì)胞分泌而成，是多種萜烯類物質(zhì)的混合物。目前自然界已分離鑒定出3萬多種不同結(jié)構(gòu)的萜烯和萜烯類衍生物，它們都是以異戊烯基焦磷酸（IPP）為前體，在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的催化下，形成多種多樣的萜烯類物質(zhì)[15]。根據(jù)所含異戊二烯數(shù)量的不同，分為單萜、倍半萜、雙萜、三萜、四萜、多萜等。大量研究表明，生物和非生物脅迫都能誘導(dǎo)針葉樹體內(nèi)萜烯類物質(zhì)含量的增加[16-18]。

雙萜、三萜等分子量相對較大的萜烯類化合物為粘性油狀物，當(dāng)針葉樹被昆蟲啃食或機(jī)械損傷后，傷口處立刻流出粘性樹脂，將暴露的傷口封閉，為昆蟲和病原微生物的入侵設(shè)置了一道物理屏障。同時(shí)，具有高度揮發(fā)性的單萜和倍半萜類物質(zhì)也對昆蟲起到了趨避和致死的作用[19]。

針葉樹通過調(diào)節(jié)揮發(fā)性物質(zhì)的成分和含量比例，形成了各種各樣的化學(xué)指紋圖譜，起到了不同的間接防御效應(yīng)。挪威云杉揮發(fā)物可以干擾小蠹蟲對寄主的定位、影響其產(chǎn)卵[20]；南方松揮發(fā)物可以干擾小蠹蟲信息素的釋放，從而防止小蠹蟲聚集攻擊[21]；云杉樹受小蠹蟲為害后，釋放的芳樟醇可以吸引小蠹蟲的天敵長痣羅葩金小蜂（Rhopalicus tutela Walker）過來捕食[22]。

植物在遭受生物或非生物脅迫下，其誘導(dǎo)防御的水平迅速提高，然而，有些樹木在從未受到損傷的情況下也能夠提高防御的水平。原因是種群樹木之間存在一種特殊的化學(xué)通訊，其受傷信息能在植株間傳遞，種群中的每一個(gè)個(gè)體都有可能隨時(shí)被誘導(dǎo)。例如針葉樹受害后釋放出的揮發(fā)性萜類物質(zhì)能引起鄰株樹木的抗性增加[23]，體現(xiàn)了生態(tài)防御的意義。

2.2 酚類化合物 酚類化合物是針葉樹另一類重要的防御物質(zhì)，在韌皮部多酚薄壁細(xì)胞中合成并儲存[17，24]。主要包括單元酚（木質(zhì)素、肉桂酸、香草酸）、二元酚（綠原酸）、多元酚（單寧）等。針葉樹的酚類化合物可以快速地響應(yīng)外界傷害，如十二尺小蠹（Ips sexdentatus）伴生真菌可以誘導(dǎo)樟子松內(nèi)不同酚類物質(zhì)的含量變化[25]。通常認(rèn)為，酚類化合物含量的增加是傷害誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生醌類化合物或單元酚和雙元酚，對昆蟲和病原物產(chǎn)生毒害作用。因此，酚類化合物被廣泛認(rèn)為是樹體內(nèi)的拒食素和抗真菌劑。

3 誘導(dǎo)性防御的分子機(jī)制

隨著科學(xué)研究的不斷深入，人們已開始從研究傳統(tǒng)的防御物質(zhì)的合成代謝轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)領(lǐng)域研究，通過鑒定相關(guān)的信號分子、關(guān)鍵酶基因的克隆以及表達(dá)規(guī)律分析，進(jìn)一步揭示植物誘導(dǎo)性防御反應(yīng)的分子機(jī)制。

3.1 防御應(yīng)答的信號分子

3.1.1 茉莉酸類化合物。該類化合物廣泛存在于植物體中，是一種重要的生物激素，在植物生長發(fā)育中具有多種生理功能，同時(shí)也是介導(dǎo)防御反應(yīng)所必需的信號分子。茉莉酸類化合物包括茉莉酸（JA）、茉莉酸甲酯（MeJA）以及其他的衍生物等。針葉樹受到機(jī)械損傷或昆蟲取食后，茉莉酸含量迅速增加，且先于基因表達(dá)。用外源MeJA處理挪威云杉，在沒有機(jī)械損傷的情況下模擬昆蟲取食，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeJA誘導(dǎo)樹木產(chǎn)生了與機(jī)械損傷和昆蟲取食相似的防御效果，萜烯含量顯著增加，在后期也可以形成新的創(chuàng)傷樹脂道[26-27]。但是研究表明，MeJA并不是直接誘導(dǎo)這些變化的單一信號分子，而是處于信號通路的上游。

3.1.2 乙烯。乙烯在生理上屬于一種氣態(tài)的植物激素，被認(rèn)為是茉莉酸下游的信號分子[28]。茉莉酸甲酯處理花旗松，可以誘導(dǎo)乙烯含量的升高[29]。用乙烯處理針葉樹也可以誘導(dǎo)萜烯含量的增加和創(chuàng)傷樹脂道的形成[26]。利用乙烯抑制劑1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）能夠抑制針葉樹創(chuàng)傷后的防御應(yīng)答反應(yīng)[29]，說明乙烯是針葉樹啟動(dòng)防御反應(yīng)的重要的信號分子。

3.2 防御基因表達(dá)

3.2.1 萜烯合成酶基因。萜烯合成酶（Terpene synthase，TPS）是萜烯類物質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵酶，按形成產(chǎn)物的不同，可分為單萜烯合成酶、倍半萜烯合成酶和二萜烯合成酶等[30-31]。目前，在針葉樹中已報(bào)道了70多種TPS基因，主要集中在松科（Pinaceae），其中以大冷杉（Abies grandis）居多，挪威云杉（Picea abies）次之，而松屬（Pinus）較少。已報(bào)道的這些TPS基因中，又以單萜烯合成酶基因居多，如蒎烯合成酶基因、檸檬烯合成酶基因、水芹烯合成酶基因等。

萜烯合成酶基因?qū)Φ捻憫?yīng)是極為迅速的，mRNA積累最早可發(fā)生在創(chuàng)傷后2 h內(nèi)，是針葉樹重要的防御基因。已有大量研究證實(shí)，外界傷害可以誘導(dǎo)TPS基因上調(diào)表達(dá)，最終調(diào)控了下游萜烯類化合物的生成。北美云杉在受到象鼻蟲取食后，α-蒎烯合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平在第1天便升到了2倍，第2～4天差異更加顯著[9]。用鉆孔的方式模擬象鼻蟲取食，發(fā)現(xiàn)單萜烯合成酶基因（PsTPS-Lim）在創(chuàng)傷后6 h轉(zhuǎn)錄水平就開始增加，并在創(chuàng)傷后的第4～7天達(dá)到最高[32]。

3.2.2 細(xì)胞色素氧化酶P450基因。最新研究發(fā)現(xiàn)，除萜烯合成酶以外，針葉樹中還存在一類酶，也參與調(diào)控了萜烯類化合物的合成，即細(xì)胞色素氧化酶P450（Cytochrome P450 monooxygenases，CYP450），它是一類血紅蛋白超家族，是一種末端氧化酶。針葉樹基因組中P450家族的總基因數(shù)量未知，目前在火炬松上已克隆出99種P450基因，但只有少數(shù)幾種進(jìn)行了功能鑒定，確認(rèn)與萜烯合成過程相關(guān)。

通過對火炬松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，得到了P450家族成員CYP720B的基因信息，它也是一個(gè)龐大的基因家族，與TPS基因家族相似[33]。針葉樹CYP720B基因能夠被傷害誘導(dǎo)激活，在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白豐度、酶活性水平上都得到提高，說明CYP720B基因是針葉樹重要的防御響應(yīng)基因。其中，CYP720B1基因以雙萜烯、醇類、醛類為底物，至少連續(xù)催化了2次以上的氧化反應(yīng)[33]。由于底物具有特異性和多樣性的特點(diǎn)，少數(shù)幾種P450基因即可調(diào)控合成多種雙萜烯產(chǎn)物。白云杉CYP720B4基因最終催化了24種雙萜烯的氧化反應(yīng)[34]。

3.3 防御相關(guān)蛋白 針葉樹防御蛋白主要指樹體內(nèi)的一些可溶性酶類，通常分子量小于100 kDa，包括結(jié)構(gòu)相關(guān)防御蛋白和化學(xué)防御相關(guān)蛋白。樹木受傷害誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶類，如過氧化物酶、漆酶，可加速寄主細(xì)胞壁木質(zhì)化，增加其硬度，在結(jié)構(gòu)上阻擋有害生物的入侵行為。另一類化學(xué)防御相關(guān)蛋白，如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶，它們可以破壞真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，抑制菌絲生長，具有直接的殺菌作用[35]。還有一些其他的蛋白，屬于蛋白酶和淀粉酶抑制劑，能夠降解有害生物分泌釋放的消化酶的活性（如孔蛋白、凝集素），干預(yù)了有害生物對罹病組織的進(jìn)一步傷害[36]。誘導(dǎo)防御蛋白具有很高的特異性，在挪威云杉中，幾丁質(zhì)酶是一個(gè)大的蛋白家族，但是真菌侵染只能誘導(dǎo)極少數(shù)的家族成員含量的升高[6]。

4 誘導(dǎo)性防御反應(yīng)的代價(jià)

植物從感知外界脅迫到獲得系統(tǒng)抗性，存在一定的時(shí)間間隔。通常在起初的幾天內(nèi)對脅迫傷害都很敏感，防御反應(yīng)相對活躍，然而隨著脅迫天數(shù)的增加，植物系統(tǒng)抗性得到了提高，自身的適應(yīng)度卻開始降低，這時(shí)因?yàn)橹参锏哪芰抠Y源是有限的，植物為防御反應(yīng)付出了代價(jià)[37]。在健康狀態(tài)時(shí)，能量主要用于快速生長和繁殖；當(dāng)受到傷害后，植物選擇將有限的資源分配給次生代謝產(chǎn)物的合成，增加防御能力來維持生存，這種能量的消耗明顯高于初生代謝。植物誘導(dǎo)性防御反應(yīng)會消耗大量的氮元素，爭奪合成蛋白質(zhì)的前體，從而使植物的生長受到抑制。針葉樹萜烯產(chǎn)物的合成步驟更為復(fù)雜，過程中需要大量的化學(xué)消耗和許多的酶解轉(zhuǎn)化，其防御成本也更為昂貴。誘導(dǎo)性防御的代價(jià)是不可避免的，植物會設(shè)計(jì)出一套最佳的防御策略，只有在需要的時(shí)候，需要的部位，以必要的數(shù)量來消耗防御的能量，實(shí)現(xiàn)有限資源的最優(yōu)化配置。

5 總結(jié)與展望

迄今為止，大量的有關(guān)植物防御反應(yīng)的研究都集中在了草本植物，針葉樹由于生長周期較長，并且可能會連續(xù)多年或同時(shí)受到多種病蟲的危害，因此更需要加強(qiáng)自身的防御能力來進(jìn)行保護(hù)，其防御機(jī)制也更為復(fù)雜。大冷杉和挪威云杉已成為研究針葉樹防御反應(yīng)的模式生物。茉莉酸類化合物也常被用來模擬機(jī)械損傷和昆蟲取食危害的激發(fā)子。越來越多的研究開始著重于防御相關(guān)基因的克隆以及表達(dá)規(guī)律分析，旨在從分子水平上深度揭示針葉樹的防御機(jī)制。在植食性昆蟲、病原物與針葉樹互作過程中，面對樹木強(qiáng)大而復(fù)雜的防御反應(yīng)，昆蟲和病原物有著怎樣的應(yīng)對策略，它們是如何躲避、利用或降解針葉樹木釋放的“有毒”物質(zhì)，這些都是值得關(guān)注的領(lǐng)域，對于樹木的病蟲害防治具有重要的意義。

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