施滿容 龔林光 鐘幼雄

摘要對(duì)福建不同地區(qū)野生金線蓮和組培苗4、6月栽培種進(jìn)行多糖、黃酮、氨基酸、總生物堿含量測(cè)定，結(jié)果表明，閩南野生金線蓮4種成分含量均高于閩東野生種，多糖和總氨基酸含量組培苗栽培種均高于野生種，且隨栽培月齡增加而下降；總黃酮和總生物堿含量表現(xiàn)隨栽培月齡增加而上升，組培栽培6個(gè)月最高，其次是閩南野生種。

關(guān)鍵詞金線蓮；多糖；黃酮；氨基酸；總生物堿

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09731-04

Research of Activity Components in Different Anoectochilus roxburghii

SHI Manrong1， GONG Linguang2， ZHONG Youxiong1

（1. Ningde Vocational and Technical College， Fuan， Fujian 355000； 2. Fuan Mastery in Quality Supervision and Inspection， Fuan， Fujian 355000）

AbstractPolysaccharides， flavonoids， amino acid， the content of total alkaloids in wild Anoectochilus roxburghii from different regions of Fujian Province and tissue culture seedling（cultivated species in April， June ） were determined. The results showed that， for four kinds of components in wild Anoectochilus roxburghii in south of Fujian， polysaccharides and total amino acid content in plant tissue culture are higher than the wild species in east of Fujian Province， and declines as the cultivation age increases. Total flavonoids and total alkaloids rises as the cultivation age increases. Tissue culture and cultivation are highest in six months， and the second is the wild species in south of Fujian Province.

Key wordsAnoectochilus roxburghii； Polysaccharides； Flavonoids； Amino acid； Total alkaloids

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）系蘭科開唇蘭屬（金線蓮屬）多年生草本植物，該屬植物已發(fā)現(xiàn)有35種，在我國約有20種[1]。金線蓮主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)及大洋洲，我國主要分布在海拔 300～1 200 m 的丘陵地，福建、廣西、廣東、海南、四川、云南、貴州等均有野生金線蓮。金線蓮對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，加之近年自然環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞，以及人工過度采挖，野生金線蓮越來越少。它在民間使用范圍較廣，素有“藥王”、“神藥”、“金草”、“烏人參”等美稱。有研究表明，金線蓮中氨基酸組成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于國產(chǎn)和野生西洋參[2]。金線蓮富含多糖、氨基酸、生物堿、黃酮化合物、微量元素、強(qiáng)心苷類、有機(jī)酸、甾體化合物等[3]。藥效學(xué)研究證實(shí)了金線蓮全草水煎液具有降血糖作用[4]，所含的微量元素、多糖、氨基酸等具有抗衰老、提高機(jī)體免疫力的作用[5]。該試驗(yàn)對(duì)福建閩東地區(qū)野生金線蓮、閩南地區(qū)野生金線蓮和金線蓮組培苗栽培4月齡、6月齡苗，進(jìn)行了多糖、黃酮、氨基酸、生物堿的測(cè)定，以期為更好地保護(hù)野生金線蓮資源、進(jìn)行組織培養(yǎng)材料選擇、開發(fā)利用栽培金線蓮以及可持續(xù)發(fā)展金線蓮產(chǎn)業(yè)提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。金線蓮組培栽培4個(gè)月苗、金線蓮組培栽培6個(gè)月苗、閩南野生金線蓮苗、閩東野生金線蓮苗。測(cè)定時(shí)間為2014年5月26～28日。

1.1.2主要儀器。7520型紫外可見分光光度計(jì)，購自北京普析通用儀器有限公司；EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自EYELA公司；SHBIII循環(huán)水式真空泵，購自河南鄭州長城科工貿(mào)有限公司；EASYpure II超純水儀，購自BarnsTead公司；Sartorius BS 210S 電子天平，購自Sartorius公司。

1.1.3主要試劑。蘆丁、甘氨酸、鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海江萊生物科技有限公司；無水葡萄糖、三氯化鋁、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、檸檬酸、氰化鉀、乙二醇甲醚、茚三酮等試劑均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1多糖含量的測(cè)定。

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于試管（ 18 mm×180 mm）中，加蒸餾水至1.0 ml，加入2.0%苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，混勻，沸水浴加熱 2 min，冷卻后于分光光度計(jì)490 nm 處測(cè)定吸光度。以試劑空白溶液為參比，以吸光度（X）為橫坐標(biāo)、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取500 mg，置于25 ml容量瓶中，加水至刻度，于80 ℃水浴加熱90 min，冷卻至室溫，提取液搖勻后過濾。濾液中加入50.0 ml無水乙醇，6 000 r/min離心，棄上清液，沉淀用90%乙醇洗滌2次，6 000 r/min離心，棄上清液，沉淀加水溶解，定容至25 ml，即得樣品液。

1.2.2總氨基酸含量的測(cè)定。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取標(biāo)準(zhǔn)氨基酸母液將其稀釋成一定濃度，取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液1 ml，加 0.2 mol/L檸檬酸緩沖溶液（pH=5.0）1 ml，充分混和，加入1 ml KCN-乙二醇甲醚-茚三酮溶液，充分混勻后在100 ℃沸水浴中加熱15 min，取出立即加入3 ml 60%乙醇稀釋。冷卻后，選擇波長570 nm進(jìn)行比色，以吸光度（X）為橫坐標(biāo)、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取500 mg，置于研缽中加少量80%乙醇，研磨成勻漿，移于25 ml容量瓶中，用乙醇將殘?jiān)慈肫恐?，最后定容至刻度。過濾，在室溫下減壓蒸發(fā)干燥，蒸發(fā)的最后階段在表面皿上進(jìn)行，得到固形物。使用前用蒸餾水溶解，定容至25 ml，即得樣品液。

1.2.3黃酮含量的測(cè)定。

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用三氯化鋁顯色法測(cè)定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg，用乙醇溶解后定容至10 ml，配成0.4 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml分別至10 ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻。分別取1 ml上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液于10 ml干凈試管中，加入1%三氯化鋁溶液0.5 ml以及30%乙醇2.0 ml，振蕩搖勻，靜置反應(yīng)15 min后在420 nm波長下測(cè)定吸光度值，并以吸光度（X）為橫坐標(biāo)、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取500 mg，置于錐形瓶中，加無水乙醇25 ml，超聲處理（功率350 W、頻率50 kHz、溫度60 ℃）2 h，濾紙過濾，定容至25 ml，即得金線蓮樣品溶液。

1.2.4總生物堿含量的測(cè)定。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取鹽酸麻黃堿對(duì)照品母液將其稀釋成一定濃度，取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)鹽酸麻黃堿溶液1 ml，再精確加入5 ml pH=5.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、1 ml 0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液、氯仿10 ml，振搖混勻待用。另取1 ml二次純化水，同法操作，作為空白對(duì)照液，取氯仿層，在波長418 nm進(jìn)行比色，以吸光度（X）為橫坐標(biāo)、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取1 g，于錐形瓶中用50 ml pH=3的酸性水溶液在功率為70 W、溫度為60度的超聲條件下提取1h，提取2次，合并提取液；提取液用氨水調(diào)節(jié)pH至10，于分液漏斗中用等體積氯仿萃取，氯仿萃取液即為樣品液。

2結(jié)果與分析

2.1多糖、總黃酮、總氨基酸、總生物堿回歸方程

對(duì)金線蓮多糖、總黃酮、總氨基酸、總生物堿的含量進(jìn)行測(cè)定，分別得到葡萄糖、 蘆丁、氨基酸、總生物堿的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）以及金線蓮的多糖、總黃酮、總氨基酸和總生物堿測(cè)定回歸方程分別為：Y=0.068 3X+0.003 8（R2=0.999 8）、Y=0.101 5X+0.009 2（R2=0.999 6）、Y=0.095 7X+0.004 6（R2=0.999 6）、Y=0.113 7x-0.020 0（R2=0.999 7）。

圖1葡萄糖（a）、 蘆?。╞）、氨基酸（c）和總生物堿（d）標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2不同來源金線蓮多糖含量的比較

從不同來源和不同栽培月齡金線蓮多糖含量測(cè)定結(jié)果（圖2）可以看出，4種金線蓮多糖含量為4.74%～10.70%，組培苗栽培種多糖含量均高于野生種，組培苗栽培4個(gè)月多糖含量高于栽培6個(gè)月多糖含量，閩南野生金線蓮多糖含量高于閩東野生種。這可能是由于培養(yǎng)基中碳素營養(yǎng)豐富，有利于糖類的積累，故組培苗栽培種多糖含量高于野生種；同時(shí)組培苗栽培4個(gè)月的金線蓮繼代時(shí)積累的多糖存在較多，而6個(gè)月栽培苗可能多糖已參與物質(zhì)的代謝過程，故含量有所下降。閩南野生金線蓮多糖含量高于閩東野生種可能是由于兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個(gè)地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖2不同來源金線蓮多糖含量比較

2.3不同來源金線蓮總黃酮含量的比較

由圖3可見，不同地區(qū)和不同栽培月齡金線蓮總黃酮含量為0.38%～0.67%，組培苗栽培6個(gè)月總黃酮含量高于4個(gè)月栽培種，閩南野生金線蓮總黃酮含量高于閩東野生種，其中組培苗栽培6個(gè)月總黃酮含量最高，為0.67%，其次是閩南野生種，為0.46%，閩東野生種表現(xiàn)最低，為0.38%。這可能是由于隨著栽培時(shí)間的延長組培苗中原積累的多糖參與物質(zhì)代謝，促進(jìn)了栽培苗內(nèi)黃酮的積累；至于2個(gè)地區(qū)野生種黃酮含量差異可能是由于兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個(gè)地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖3不同來源金線蓮黃酮含量比較

2.4不同來源金線蓮總氨基酸含量的比較

從圖4可以看出，不同地區(qū)和不同栽培月齡金線蓮總氨基酸含量為3.26%～6.10%，組培苗栽培4個(gè)月總氨基酸含量（6.10%）高于6個(gè)月栽培種（4.14%），閩南野生金線蓮總氨基酸含量（3.30%）略高于閩東野生種（3.26%），組培苗栽培種總氨基酸含量均高于野生種。這可能是由于組培苗原培養(yǎng)基中含氮化合物有利于積累氨基酸，故組培苗栽培種氨基酸含量均高于野生種，隨著栽培時(shí)間延長，氨基酸重新參與物質(zhì)代謝，故表現(xiàn)出6個(gè)月栽培種含量小于4個(gè)月栽培種。閩南野生金線蓮氨基酸含量高于閩東野生種可能是由于兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個(gè)地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖4不同來源金線蓮氨基酸含量比較

2.5不同來源金線蓮總生物堿含量的比較

由圖5可見，不同地區(qū)和不同栽培月齡金線蓮總生物堿含量為0.029%～0.066%，組培苗栽培6個(gè)月總生物堿含量高于4個(gè)月栽培種，閩南野生金線蓮總生物堿含量高于閩東野生種，其中組培苗栽培6個(gè)月總生物堿含量最高，為0.066%，其次是閩南野生種，為0.051%，閩東野生種表現(xiàn)最低，為0.029%。這可能是由于隨著栽培時(shí)間延長，組培苗內(nèi)積累的營養(yǎng)物質(zhì)參與代謝，有利于生物堿的合成。至于2個(gè)地區(qū)野生種生物堿含量差異可能是由于本身兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個(gè)地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖5不同來源金線蓮生物堿含量比較

42卷28期

施滿容等不同來源金線蓮活性成分含量的研究

3結(jié)論與討論

對(duì)福建不同地區(qū)和不同栽培月齡組培苗進(jìn)行多糖、總氨基酸、總黃酮、總生物堿含量的測(cè)定，結(jié)果表明，多糖和總氨基酸含量組培苗栽培種均高于野生種，且隨著栽培時(shí)間增加而下降；總黃酮和總生物堿含量均表現(xiàn)隨著栽培時(shí)間增加而上升，其中組培栽培6個(gè)月最高，其次是閩南野生種，4種有效成分含量閩東野生種均表現(xiàn)為最低，這是否是由于閩東野生種苗較小，處于生長初期還是由于本身遺傳物質(zhì)差異或2個(gè)地方生態(tài)環(huán)境等自然因素差異有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。多糖含量隨栽培時(shí)間增加而下降，而總黃酮含量隨栽培時(shí)間增加而上升，這結(jié)果與黃瑞平等的測(cè)定結(jié)果[6]一致。這可能是因?yàn)榻鹁€蓮在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基營養(yǎng)較豐富，植物的合成代謝較旺盛，多糖和氨基酸作為植物營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)持續(xù)積累，金線蓮移入栽培基質(zhì)后，原積累的多糖和氨基酸參與代謝，故隨著栽培時(shí)間延長含量降低；黃酮和生物堿作為次生代謝物，可能是在特定環(huán)境條件下會(huì)增加其合成量，所以，金線蓮總黃酮和生物堿含量隨著栽培月齡的增加而增加。多糖、總氨基酸、總黃酮、總生物堿是金線蓮的主要有效成分，是金線蓮產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要成分，其含量的多少將直接影響金線蓮及其相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用功效。

多糖含量栽培4個(gè)月最高，達(dá)10.70%，比黃瑞平等研究的福建4月齡高[6] ，較王常青等報(bào)道的從臺(tái)灣金線蓮試管苗中測(cè)得水溶性多糖含量（11.1%）稍低[7]，比趙保發(fā)等用水提法從金線蓮干草中提取的最高多糖含量（8.23%）高2.47%[8]。4個(gè)樣品黃酮含量測(cè)定結(jié)果比黃瑞平等的研究結(jié)果[6，9]稍低，但與張志信等報(bào)道的野生金線蓮（0.4%）含量相當(dāng)或略高[10]。生物堿也是金線蓮的活性成分之一，該研究中，總生物堿的積累以栽培6個(gè)月組培苗最高，達(dá)0.066%，與林麗清等報(bào)道的金線蓮干草中最高含量（0.052 96%）高出0.013%，是最低含量（0.033 20%）的2倍[3]。

測(cè)定結(jié)果表明，組培苗栽培4～6月，多糖、總黃酮、總氨基酸、總生物堿含量可以達(dá)到甚至超過野生種，在野生資源日益減少的情況下，大力開展組織培養(yǎng)工作來發(fā)展金線蓮產(chǎn)業(yè)，對(duì)保護(hù)野生植物資源、滿足市場對(duì)金線蓮作為保健品和藥用的需求以及為觀賞園藝提供種苗均具有非常重要意義。

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