李璐璐 駱延波 胡明等

中圖分類號(hào)：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2014）09-0020-04

藥敏試驗(yàn)是藥理學(xué)研究與應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，其標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于不同試驗(yàn)者比較結(jié)果、指導(dǎo)臨床治療以及流行病學(xué)調(diào)查都至關(guān)重要。本文概括了藥敏試驗(yàn)制定的原理和方法，并著重比較了臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI，前身為NCCLS，www. clsi. org）和歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST，www. eucast.org）兩大機(jī)構(gòu)制定的標(biāo)準(zhǔn)間差異，幫助理解和應(yīng)用這些國際藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1 藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)制定的原理和方法

藥敏試驗(yàn)有兩重目標(biāo)，一是作為抗藥性流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，二是外推到體內(nèi)殺菌效果，以指導(dǎo)臨床治療。目前主要通過標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏試驗(yàn)來測定最小抑菌濃度（MIC）或抑菌圈直徑，再根據(jù)各大機(jī)構(gòu)制定的折點(diǎn)（breakpiont）判定標(biāo)準(zhǔn)確定測定的菌株歸類為敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）。依據(jù)試驗(yàn)方法的不同，藥敏試驗(yàn)結(jié)果通?？梢杂脻舛龋╩g/L或μg/ml）或抑菌圈直徑（mm）來表示。

制定一個(gè)合適的折點(diǎn)，至少需要以下四方面的資料：①M(fèi)IC分布和野生型截點(diǎn)（cutoff）數(shù)值；②體外的抗藥性標(biāo)志，包括抗藥表型和基因型；③動(dòng)物模型和研究中的PK/PD數(shù)據(jù)；④合適的臨床研究和這些研究中可能引起感染的致病菌的MICs的臨床和細(xì)菌學(xué)數(shù)據(jù)[1]。當(dāng)制定抑菌圈直徑的折點(diǎn)時(shí)，需要使用額外的方法（error-rate-bounded方法）來確定抑菌圈直徑與MIC之間的關(guān)系。

首先，體外用肉湯或瓊脂稀釋法測定抗生素對(duì)病原菌的MIC分布。在選取病原菌的分離菌株時(shí)，應(yīng)盡可能選擇來源廣泛的菌株，這里的來源不僅指區(qū)域，還包括動(dòng)物種類（健康或患病、禽源或豬源等）。在獲得MIC數(shù)據(jù)之后，一般采用繪制直方圖的方法，一方面區(qū)分野生型菌株和臨床型菌株；另一方面可以直觀的確定野生型菌株的截點(diǎn)數(shù)值。這里的野生型菌株一般是指對(duì)特定的抗生素沒有獲得性或者選擇性的抗藥性機(jī)制[2]。EUCAST的網(wǎng)站（www.eucast.org）上有許多公開的針對(duì)特定細(xì)菌-抗生素組合的表格和直方圖可供查詢（如圖1），這些數(shù)據(jù)來源于不同國家，采用特定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

在確定細(xì)菌中某種抗藥性機(jī)制存在與否時(shí)，經(jīng)常采用表型測定或基因型測定的方法。CLSI中規(guī)定了許多既成的表型測定方法，如苯唑西林、萬古霉素等的藥物平板篩選試驗(yàn)、高水平氨基糖苷類的篩選試驗(yàn)、產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法、克林霉素的誘導(dǎo)性試驗(yàn)等?；蛐蜋z測多是對(duì)表型測定試驗(yàn)的確證，并且在大多數(shù)情況下，二者是相符的。而葡萄球菌中mecA基因的檢測常常有一些例外。對(duì)于金黃色葡萄球菌，當(dāng)苯唑西林的MIC≥2mg/L時(shí)，菌株通常會(huì)攜帶mecA基因；而對(duì)于凝固酶陰性葡萄球菌，當(dāng)苯唑西林的MIC≥0.5mg/L時(shí)，菌株通常會(huì)攜帶mecA基因。

要把體外測定的MIC與體內(nèi)殺菌效果及療效聯(lián)系起來時(shí)，就需要考慮藥物毒理學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)，在毒理學(xué)確定的安全使用范圍內(nèi)設(shè)定抗生素的給藥濃度和方案，測定體液中藥物濃度曲線及PK參數(shù)Cmax、AUC、T>MIC，確定PK模型；一般來說，血流感染被認(rèn)為是最常見的復(fù)雜感染類型，因此血中藥物的PK參數(shù)被用于設(shè)定折點(diǎn)。同時(shí)，針對(duì)一定MIC的菌株感染的動(dòng)物按照同樣劑量治療，計(jì)算PK/PD參數(shù)：AUC/MIC、Cmax/MIC、T>MIC，如圖2所示：

T>MIC：指給藥后，血藥濃度高于MIC的持續(xù)時(shí)間。通常以占一個(gè)給藥區(qū)間的百分比表示。

Cmax/MIC：抗菌藥物血藥峰濃度和MIC的比值。

AUIC：指血藥濃度-時(shí)間曲線圖中，MIC以上的AUC部分，一般以24h的AUC與MIC的比值A(chǔ)UC/MIC表示。

在PK穩(wěn)定，給藥劑量固定的情況下，療效就與MIC呈現(xiàn)較強(qiáng)相關(guān)性，據(jù)此確定折點(diǎn)--S-I-R：

在上述參數(shù)之外，還要考慮藥物的另外兩個(gè)特征：藥物屬于時(shí)間依賴型藥物或濃度依賴型藥物，藥物的抗菌后效應(yīng)（PAE）。

此外，還需進(jìn)行一系列的臨床試驗(yàn)證明MIC與治療療效之間的關(guān)系。但是由于獸醫(yī)臨床上，動(dòng)物發(fā)病常常是混合型感染居多，單一致病菌引起發(fā)病的案例較少，因此制約了臨床試驗(yàn)的進(jìn)行。由于臨床治療的病例數(shù)量限制，上述數(shù)據(jù)達(dá)不到統(tǒng)計(jì)的要求，通過蒙特卡洛模擬可以極大地?cái)U(kuò)充數(shù)據(jù)，得到更準(zhǔn)確的給藥劑量和相關(guān)性[3，4]，PK/PD參數(shù)達(dá)到一定范圍才能保證治愈的療效，見表1。

2 EUCAST與CLSI藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的主要差異

2.1 歷史與普及性 成立于1967年的NCCLS（現(xiàn)為CLSI），自1993年版引進(jìn)中國后，每版的修訂都有專家翻譯介紹，其標(biāo)準(zhǔn)引進(jìn)歷史長，修訂及時(shí)，與臨床結(jié)合密切，并成為中國衛(wèi)生部所頒布的標(biāo)準(zhǔn)，與WHONET結(jié)合建立世界范圍的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，在國內(nèi)衛(wèi)生界普遍接受。CLSI也有獸醫(yī)病原菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，配套翻譯引進(jìn)，自成體系，容易融合。而EUCAST創(chuàng)建于1997年，2002年統(tǒng)一歐洲標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)對(duì)其研究和應(yīng)用較少，但EUCAST 的專家規(guī)則（Expert rules）和流行病學(xué)截點(diǎn)可以借鑒，作為CLSI的補(bǔ)充。

2.2 原理與文件形式 CLSI將MIC分布、PK/PD參數(shù)和臨床療效密切結(jié)合起來，按照三者關(guān)系確定折點(diǎn)[5]，其主要文件是標(biāo)準(zhǔn)化藥敏試驗(yàn)的準(zhǔn)則和規(guī)程、獸醫(yī)病原菌抑菌圈直徑和MIC的折點(diǎn)值解釋標(biāo)準(zhǔn)；而EUCAST在制定折點(diǎn)時(shí)，除考慮MIC分布、PK/PD參數(shù)及臨床療效外，還考慮藥物在體外的特征[6]，EUCAST制定了完整的專家規(guī)則，注明天然抗藥性、例外的抗藥性表型（可能新的抗藥性機(jī)制），對(duì)每組抗菌藥物與病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果的解釋。

CLSI不注重MIC分布，注重MIC與療效的關(guān)系，根據(jù)抗藥性的發(fā)展、新機(jī)制和臨床治療實(shí)際情況，實(shí)用性強(qiáng)。而EUCAST除了歐盟自己測定的野生菌株MIC以外，還引用了大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，通過直方圖可以直觀地顯示出幾千甚至上萬株野生型菌株的MIC分布，是抗藥性流行病學(xué)非常重要的技術(shù)資料，彌足珍貴。

2.3 折點(diǎn)值 CLSI文件中，僅規(guī)定運(yùn)用折點(diǎn)來區(qū)分敏感、中介與耐藥，而EUCAST則在此基礎(chǔ)上，提出流行病學(xué)截點(diǎn)的定義，以與臨床型折點(diǎn)值予以區(qū)分。歐盟組織認(rèn)為臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該每天使用臨床型折點(diǎn)值以對(duì)病人的治療提供有價(jià)值的建議，而流行病學(xué)cut-off數(shù)值則是醫(yī)院和社區(qū)的抗藥性發(fā)展過程中最為敏感的測量數(shù)據(jù)，可以用于衡量預(yù)防干預(yù)的效果，以及作為策略來對(duì)抗未來的抗藥性的發(fā)展。由于流行病學(xué)截點(diǎn)常常是基于MIC的分布而獲得，與劑量無關(guān)，因此這個(gè)數(shù)值往往低于臨床型折點(diǎn)值，見表2。如腸桿菌對(duì)各種抗生素的折點(diǎn)，顯著低于CLSI標(biāo)準(zhǔn)。此外，EUCAST還在文件的最后注明每種藥物的PK/PD折點(diǎn)值。

2.4 藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程細(xì)節(jié)的差異 培養(yǎng)基的選擇：CLSI和EUCAST對(duì)于常規(guī)細(xì)菌均選用MH瓊脂（MHA）和MH肉湯（MHB）進(jìn)行稀釋法和擴(kuò)散法的試驗(yàn)，但對(duì)于一些不易培養(yǎng)的特殊菌群，EUCAST均采用MHF瓊脂/肉湯（MH瓊脂/肉湯+5%脫纖維馬血+20mg/L β-NAD）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，而CLSI則進(jìn)行了更進(jìn)一步的細(xì)化。如睡眠嗜血桿菌與胸膜肺炎放線桿菌選用巧克力瓊脂，鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌與空腸彎曲桿菌選擇添加5%脫纖維羊血的MHA，李斯特菌選用添加2%～5%的脫纖維羊血的MHB。

接種物制備：CLSI和EUCAST規(guī)定的接種物均需符合0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊臉?biāo)準(zhǔn)，但CLSI規(guī)定可采用生長法或菌懸液制備法制備接種物，而EUCAST則推薦菌懸液制備法。此外，EUCAST文件中，當(dāng)使用血平板孵育鏈球菌時(shí)，麥?zhǔn)蠞岫热匀粦?yīng)符合0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)，而當(dāng)采用巧克力平板孵育鏈球菌時(shí)，麥?zhǔn)蠞岫葢?yīng)符合1.0麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)。

質(zhì)控菌株的選擇：CLSI推薦的質(zhì)控菌株均為美國微生物保藏中心所收藏的ATCC菌株；而EUCAST除包括上述菌株外，還可使用來自于其他國家保藏中心的菌株作為質(zhì)控菌株。

孵育時(shí)間：CLSI中，常規(guī)易培養(yǎng)細(xì)菌的孵育時(shí)間一般為16～20h，但也對(duì)一些難培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了其他規(guī)定：如豬葡萄球菌、巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌為18～24h，睡眠嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌與李斯特菌為20～24h，空腸彎曲桿菌條件更為特殊，36～37℃孵育48h或者42℃孵育24h；而EUCAST中，除空腸彎曲桿菌42℃孵育24h以及腸球菌對(duì)糖肽類的藥敏試驗(yàn)需孵育24h外，其余細(xì)菌均需孵育18～20h。

3 藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展趨勢

隨著藥理學(xué)研究深入和臨床用藥的擴(kuò)展，抗藥性也會(huì)變化，藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)必然有所發(fā)展：

3.1 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的最終目的是控制抗藥性，為臨床治療服務(wù)。控制抗藥性是生態(tài)學(xué)、藥品管理政策、醫(yī)療成本、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和人畜健康的權(quán)衡，嚴(yán)苛的抗生素管理，必然降低抗藥性，但人畜健康難以保障；寬松的管理政策，則造成抗藥性水平提高和流行，醫(yī)療成本增加。同時(shí)，不同區(qū)域用藥劑量和習(xí)慣不同，因此藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一還有一個(gè)較長的較困難的路要走。

3.2 隨著抗藥性機(jī)制研究的深入和新機(jī)制的產(chǎn)生、發(fā)現(xiàn)，需要修改標(biāo)準(zhǔn)。例如，2010年1月CLSI修改M100-S20，降低頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松和氨曲南對(duì)腸桿菌科菌的折點(diǎn)，并在折點(diǎn)后增加了對(duì)應(yīng)的用藥方案，更好地反映抗菌藥物在以目前推薦方案治療由菌株引起的感染時(shí)的真實(shí)療效[7]。

現(xiàn)在，更新的工具/數(shù)據(jù)被用于建立折點(diǎn)，如利用蒙特卡洛擬合法進(jìn)行的藥物代謝/藥效學(xué)研究，修訂的折點(diǎn)將能更好地檢測攜帶不同耐藥機(jī)制的菌株，菌株的MIC與臨床預(yù)后的相關(guān)性強(qiáng)于菌株攜帶的耐藥機(jī)制。新的折點(diǎn)將為病人治療提供更合理的信息并降低臨床實(shí)驗(yàn)室工作的不確定度和工作量。另外，靜脈用頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢替坦和頭孢西丁對(duì)腸桿菌科菌的折點(diǎn)也被重新評(píng)估但并沒有修改，因?yàn)镻K-PD評(píng)估、臨床試驗(yàn)、數(shù)據(jù)回顧和抗藥性機(jī)制等研究支持現(xiàn)有的折點(diǎn)。

3.3 新的藥理學(xué)觀念可能徹底改變藥敏試驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)。目前藥敏試驗(yàn)方法是嚴(yán)格限定所有條件，僅測定抗生素濃度變化對(duì)殺菌力和臨床療效的影響，這顯然是不全面的，殺菌過程至少涉及病原菌數(shù)量和敏感性、藥物在體內(nèi)濃度變化以及藥物作用時(shí)間，目前PK/PD參數(shù)依然是經(jīng)驗(yàn)值，缺乏合理的邏輯關(guān)系。除了EUCAST野生菌株MIC分布保留和擴(kuò)充，以監(jiān)測抗藥性流行病學(xué)外，包含病原菌數(shù)量、藥物濃度和作用時(shí)間的新的藥理學(xué)模型將會(huì)改變藥敏試驗(yàn)方法和給藥模式。

3.4 兼顧人畜藥理學(xué)以及藥敏試驗(yàn)方法、標(biāo)準(zhǔn)的廣泛培訓(xùn)和應(yīng)用，將使藥敏試驗(yàn)更實(shí)用，抗藥性控制更有效。

隨著不斷變化的耐藥機(jī)制和細(xì)菌菌群分布以及人們對(duì)臨床反應(yīng)藥理學(xué)因素的認(rèn)識(shí)不斷加深，針對(duì)不同的感染類型、人群和給藥模式，折點(diǎn)將會(huì)更加合理化。

在綜合考慮不同地區(qū)用藥劑量和方案差異后，統(tǒng)一不同的折點(diǎn)將是未來的目標(biāo)。

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