申浩 張秀 張蕾 張延

摘 要：蛋白質(zhì)的o-糖基化（O-glycosylation）是一種重要的翻譯后修飾，參與諸多生理和病理過程。目前，對(duì)于蛋白質(zhì)的O-糖基化的研究進(jìn)展仍非常緩慢，一個(gè)重要的原因就是缺乏高效的對(duì)O-糖基化蛋白進(jìn)行分離和鑒定的技術(shù)。創(chuàng)新性地將點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)、二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，對(duì)尋找細(xì)胞內(nèi)0-糖基化蛋白進(jìn)行了技術(shù)探索性研究。首先利用代謝性標(biāo)記手段，在人肝癌細(xì)胞HCCLM6培養(yǎng)基中加入四乙?；B氮半乳糖胺（Ac4GaINAZ）對(duì)細(xì)胞內(nèi)O-GalNAc糖基化蛋白進(jìn)行標(biāo)記：其次通過點(diǎn)擊化學(xué)將炔基熒光基團(tuán)連接至標(biāo)記的O-糖基化蛋白的疊氮基團(tuán)；應(yīng)用二維電泳技術(shù)對(duì)標(biāo)記蛋白進(jìn)行分離，并找到13個(gè)具有熒光信號(hào)的蛋白點(diǎn)；最后對(duì)具有熒光信號(hào)的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功鑒定到7種蛋白，經(jīng)軟件預(yù)測(cè)后，GRP78蛋白和ANXA1蛋白均具有潛在的0-糖基化位點(diǎn)。這為尋找細(xì)胞或生物體中的O-糖基化蛋白奠定了基礎(chǔ)，并為高通量篩選O-糖基化蛋白提供技術(shù)平臺(tái)。

關(guān)鍵詞：O-糖基化蛋白；點(diǎn)擊化學(xué)；二維電泳；質(zhì)譜技術(shù)

中圖分類號(hào)：Q599

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）05-0377-05

糖基化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，存在于生物體內(nèi)超過一半的蛋白質(zhì)中。糖基化修飾對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有顯著影響，參與調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞粘附、免疫應(yīng)答等牛物學(xué)過程.除此之外，異常的糖基化修飾與諸多疾病有密切關(guān)系，粘蛋白型O-糖基化是一類廣泛仔在的蛋白質(zhì)糖基化修飾，其合成的第一步為：UDP-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNAc：，供體）通過多肽N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（pp-GalNAc-Ts）的催化連接在蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基（受體）的羥基氧上。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列，缺乏通用的糖苷酶以及O-糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性等原因，目前對(duì)于蛋白質(zhì)O-糖基化的分析仍處于方法開發(fā)階段。生物正交點(diǎn)擊化學(xué)（bioorthogonalClick chemistry）可經(jīng)簡(jiǎn)單的疊氮一炔基環(huán)化加成反應(yīng)將含炔基檢測(cè)標(biāo)簽共價(jià)連接到生物兼容的疊氮標(biāo)記的待測(cè)分子上。憑借其生物相容性、生物正交性、高效性和高特異性等優(yōu)點(diǎn).此類新興技術(shù)在化學(xué)糖生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速[10，11]。基于疊氮的生物正交點(diǎn)擊化學(xué)在糖生物學(xué)研究中的應(yīng)用，主要分為以下幾個(gè)方面：1）在糖代謝過程中的應(yīng)用。在糖代謝研究的早期.Reutler教授開發(fā)了代替唾液酸的非天然N-?；愃莆铮瑸橥僖核岬难芯刻峁┝诵滤悸?。近10年來.Bertozzi教授利用施陶丁格反應(yīng)進(jìn)行糖代謝的研究，進(jìn)一步推動(dòng)了生物正交點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)展：2）在糖鏈活體成像中的應(yīng)用。目前，AC4ManNAz，AC4GalNAz和GDP-FucAz均成功地應(yīng)用于糖鏈活體成像研究中；3）在糖鏈富集和糖組學(xué)中的應(yīng)用。 NarimatsU教授將生物正交點(diǎn)擊化學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，成功的鑒定出巖藻糖基化的N -聚糖位點(diǎn)圖譜。此外，本課題組開發(fā)的一種以二硫鍵和末端炔基修飾的二氧化硅納米顆粒，可從多肽混合體系中特異性地富集疊氮標(biāo)記的多肽：4）在病毒研究中的應(yīng)用?？捎茂B氮或炔基修飾病毒表面.有利于成像和藥物傳送；5）另外，生物正交點(diǎn)擊化學(xué)在蛋白活性表達(dá)譜，糖復(fù)合物合成以及糖芯片技術(shù)中也有廣泛的應(yīng)用。

本研究利用疊氮標(biāo)記的單糖類似物——Ac4GaINAz（圖1）對(duì)人肝癌細(xì)胞系HCCLM6進(jìn)行代謝性標(biāo)記，單糖類似物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)參與正常糖代謝過程.可使細(xì)胞內(nèi)的O-糖基化蛋白標(biāo)記上疊氮基團(tuán)，再通過疊氮和炔基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的熒光標(biāo)記，最后，利用二維電泳技術(shù)將蛋白進(jìn)行分離以及MALDI—T0F質(zhì)譜對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定（實(shí)驗(yàn)流程見圖2）。本研究為尋找O一糖基化蛋白建立了良好的技術(shù)平臺(tái)，為蛋白質(zhì)O-糖基化的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞系HCCLM6南人類基因組南方研究中心張新教授惠贈(zèng)。

1.1.2 相關(guān)試劑

胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)白美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶消化液（Try psin）和AlexaFluor 555熒光試劑（炔基熒光試劑，Alkynyl fluophor）購(gòu)自美國(guó)Life technology公司；細(xì)胞裂解液成分為：1% NP-40，50 mmoUL Tris-HCL 150 mmoI/lNaCl， 0.1% SDS，Cocktail；細(xì)胞培養(yǎng)基DMFM/HICJH GLUCOSE、BCA定量試劑盒和蛋白 Marker購(gòu)白美國(guó)Thermo公司；四乙?；B氮半乳糖胺（AC4GalNAz）由本實(shí)驗(yàn)室工勝老師合成；CuSO4、NaVc購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；IPG膠條、兩性電解質(zhì)Bio-Lyte和礦物油購(gòu)白美國(guó)Bio-Rad公司；TBTA、DTT和IAA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；配制水化液所用試劑、平衡緩沖液所用試劑、12.5%丙烯酰胺凝膠所用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；水化上樣緩沖液成分：水化液，DTT和Bio-Lyle；平衡緩沖液I成分：平衡液，DTT和溴酚藍(lán)；平衡緩沖液Ⅱ成分：平衡液，IAA和溴酚藍(lán)、

1.1.3 儀器

等電聚焦儀和垂直電泳儀（美國(guó)Bio- Rad公司）。熒光化學(xué)發(fā)光及同位素影像掃描分析儀（fluorescent and radioisotope science imaging sys-tems，，F(xiàn)LA-5100，日本Fujifilm公司）；平板掃描儀（臺(tái)灣UMAX公司）；MALDI-TOF質(zhì)譜儀（Ultrallex

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞標(biāo)記

HCCLM6細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% C02培養(yǎng)箱，DMEM（含 10% FBS）培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期；取50 μL濃度為10 mmol/L的AC4Gal-NAz加到培養(yǎng)皿底部，待溶劑乙醇揮發(fā)，將Sxl06個(gè)細(xì)胞鋪于培養(yǎng)皿中，使標(biāo)記終濃度為100μmol/L；培養(yǎng)細(xì)胞48h。

1 .2.2 蛋白樣品的獲得

細(xì)胞標(biāo)記48h后，吸掉培養(yǎng)基并進(jìn)行胰蛋白酶消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r/min離心收集細(xì)胞；加入150 μL細(xì)胞裂解液震蕩裂解，12 000g離心30min，保留上清；BCA蛋門定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

1.2.3 疊氮一炔基環(huán)化加成反應(yīng)

定量后取300 μg總蛋白，加入1.5 μL AlexaFluor 555熒光試劑和2μL催化劑，并用PBS（pH 7.8）補(bǔ)齊至400μL，置于恒溫震蕩儀中25℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后，甲醇氯仿法進(jìn)行蛋白沉淀：樣品中加入1.2 mL甲醇并混勻，加入300 μL氯仿并混勻，加入800 μL超純水并混勻，15 000 g離心5 min棄上清，加入900 μL甲醇后15 000 g離心5 min，棄上清，空氣中風(fēng)干蛋白沉淀。

1.2.4 等電聚焦

用水化上樣緩沖液將樣品定容至300 μL；IPG預(yù)制膠條室溫放置5 min；沿電泳槽邊緣連續(xù)加入樣品.不要產(chǎn)生氣泡；去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層，將IPG膠條置于樣品中；膠條上覆蓋1 mL礦物油：進(jìn)行等電聚焦電泳。

等電聚焦電泳儀參數(shù)沒置：溶脹上樣階段：

50 V

12 h等電聚焦階段：

200 V

1h

快速升壓

500 V

1h

快速升壓

1 000 V

2h

慢速升壓

10 000 V

2h

慢速升壓

10 000 V 80 000 Vhrs 快速升壓

500 V

Hold

快速升壓

1.2.5 SDS-PAGE電泳

等電聚焦結(jié)束后，瀝干膠條上的礦物油，置于平衡緩沖液I中平衡I5 min；平衡緩沖液Ⅱ中平衡15 min；去離子水清洗殘余的緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

電泳儀參數(shù)設(shè)置：階段I：16 mA/gel 30 min階段Ⅱ：24 mA/gel 6 h

1.2.6

熒光掃描與考馬斯亮藍(lán)染色

對(duì)凝膠進(jìn)行熒光掃描，采集熒光信號(hào)，獲得熒光信號(hào)二維電泳圖；對(duì)平行凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后掃描獲得二維電泳圖譜。

1.2.7 MALDI-TOF質(zhì)譜

比對(duì)熒光信號(hào)二維電泳圖譜結(jié)果與考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，對(duì)具有熒光信號(hào)的蛋白進(jìn)行收集；進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光信號(hào)二維電泳圖譜

利用熒光化學(xué)發(fā)光及同位素影像掃描分析儀對(duì)二維電泳凝膠進(jìn)行熒光信號(hào)掃描。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，熒光信號(hào)大部分出現(xiàn)在pH堿性端，相對(duì)分子質(zhì)量40 kD附近；少部分信號(hào)出現(xiàn)在pH酸性，相對(duì)分子質(zhì)量15 kD附近。

2.2 二維電泳圖譜

熒光信號(hào)掃描以后，對(duì)同一塊二維電泳凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色，脫色后用平板掃描儀進(jìn)行掃描。結(jié)果如圖4所示。

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)熒光信號(hào)二維電泳圖譜和考馬斯亮藍(lán)染色圖譜進(jìn)行比對(duì)，尋找到13個(gè)具有熒光信號(hào)的蛋白點(diǎn)（如圖4所示）。對(duì)其進(jìn)行割膠和質(zhì)譜鑒定，成功鑒定到7種蛋白，如表1所示。我們用Net0-Glyc 3.1 Server軟件對(duì)7種蛋白的O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中GRP78蛋白和ANXA1蛋白分別具有2個(gè)和1個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

點(diǎn)擊化學(xué)具有生物相容性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，已逐步發(fā)展為極有價(jià)值的化學(xué)生物學(xué)研究方法。尤其是在糖生物學(xué)領(lǐng)域，點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)在高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)和疾病相關(guān)標(biāo)志物尋找等方面發(fā)揮了重要作用，疊氮試劑因其生物學(xué)惰性，在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（例如，小鼠和斑馬魚）中均有很大突破，應(yīng)用也最為廣泛。靈敏的選擇性和生物相容性使生物正交點(diǎn)擊化學(xué)為糖生物學(xué)研究帶來了巨大變革，基于生物正交性點(diǎn)擊化學(xué)的糖生物學(xué)研究主要包括四個(gè)方面：1）利用疊氮的反應(yīng)活性和特異性，作為捕獲底物的工具；2）用于新型生物正交性官能團(tuán)的發(fā)現(xiàn)；3）在高通量蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用；4）對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。目前，對(duì)于O-糖基化蛋白的發(fā)現(xiàn)依然基于凝集素富集技術(shù)，受限于凝集素特異性和靈敏度較差等缺點(diǎn)，尤其是在研究復(fù)雜糖鏈的過程中，這種技術(shù)思路存在較大的局限性。為建立高通量的尋找O-糖基化蛋白的技術(shù)，本研究將二維電泳技術(shù)與點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，并對(duì)利用糖探針標(biāo)記所發(fā)現(xiàn)的潛在的0—糖基化蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，所發(fā)現(xiàn)的部分蛋白經(jīng)糖基化預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)含有O-糖基化修飾位點(diǎn)。雖然目前的技術(shù)無法判定確定的糖基化修飾位點(diǎn)，但是本研究仍為O-糖基化蛋白的高通量發(fā)現(xiàn)提供了有效的技術(shù)策略。今后通過改善和優(yōu)化標(biāo)記糖蛋白的富集效率、總蛋白的分級(jí)分離能力等，將能進(jìn)一步提升熒光信號(hào)的靈敏度與O-糖蛋白的展現(xiàn)特異性，從而更加完善該技術(shù)。