韋杰 潘卉 趙揚(yáng) 馮陽(yáng)

摘 要：為了發(fā)現(xiàn)新的可用于肺癌治療的小分子藥物，從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的小分子化合物庫(kù)中.選取13個(gè)未見報(bào)道的新型哌啶并噻吩類化合物，對(duì)其抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用進(jìn)行初步評(píng)價(jià) 通過(guò)體外培養(yǎng)A549細(xì)胞.應(yīng)用WST-】法檢測(cè)小分子化合物（終濃度為10 μmol/L）處理后細(xì)胞存活率的變化，發(fā)現(xiàn)化合物11（噻吩并【2.3一c]哌啶-3-甲酰胺一2一（3一甲氧基一萘一2一羰基）一氨基]-6-芐基一.鹽酸鹽）能顯著抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制率可達(dá)到（71.34+0，96）%。對(duì)小分子化合物結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)苯并結(jié)構(gòu)可能是增強(qiáng)化合物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基團(tuán)。隨后.進(jìn)一步分析了化合物11（終濃度分別為I、2.5、5、10μmol/L）對(duì)A549細(xì)胞和正常人胚肺成纖維MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 結(jié)果表明，隨著該化合物濃度增加，對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率逐漸增大，用GraphPad Prism軟件計(jì)算出該化合物的IC50為2.407μmo1/L；而該化合物對(duì)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率顯著低于對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率.當(dāng)作用終濃度為10 μmol/L時(shí)，其對(duì)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率也只有30.41%。這些研究結(jié)果初步顯示化合物11是一種新的較為理想的治療肺癌藥物先導(dǎo)化合物的候選分子

關(guān)鍵詞：肺癌；A 549細(xì)胞：MRC-5細(xì)胞；細(xì)胞生長(zhǎng)；哌啶并噻吩：結(jié)構(gòu)活性關(guān)系

中圖分類號(hào)：Q279

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）05-0382-05

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一。近年來(lái)許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性肺癌發(fā)病率和死亡率占女性所有惡性腫瘤的第二位[1]。肺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、藥物治療、靶向治療、綜合治療等，藥物治療及靶向治療在其中占據(jù)了重要的地位[2]。目前，臨床上常用的治療肺癌的藥物有貝伐單抗、西妥昔單抗、長(zhǎng)春新堿等，雖然這些藥物對(duì)肺癌有一定的療效，但也存在著很大的毒副作用及機(jī)體對(duì)藥物的極大的耐藥性問(wèn)題，因此，開發(fā)療效顯著、靶向性強(qiáng)、毒剮作用小的新型治療藥物顯得尤為重要[3]。

化學(xué)合成的有機(jī)小分子是一種相對(duì)分子質(zhì)量小、容易進(jìn)入細(xì)胞、可以與其中的蛋白質(zhì)分子結(jié)合并影響蛋白活性的一種化合物。在抗腫瘤藥物的篩選中，這種小分子化合物也得到廣泛的應(yīng)用，篩選有活性的小分子化合物是其中的第一步。一口.篩選到活性化合物，該化合物就被視為可能的藥物先導(dǎo)化合物，后續(xù)可進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、藥理學(xué)研究、藥代動(dòng)力學(xué)分析等藥物開發(fā)的相關(guān)研究工作。、此外，就算篩到的活性化合物不適合作為藥物開發(fā)對(duì)象，進(jìn)一步尋找該化合物的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，電可發(fā)現(xiàn)一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要的新的基因，從而為藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)，因此也是具有重要意義的[4，5]。在20世紀(jì)八九十年代，快速合成結(jié)構(gòu)多樣的有機(jī)小分子的技術(shù)發(fā)腱成熟，隨后商業(yè)化的小分子化合物大量出現(xiàn)，為抗腫瘤藥物篩選及腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究提供了豐富的資源[6]。

在醫(yī)藥的研究發(fā)展過(guò)程中，含氮雜環(huán)化合物因其具有獨(dú)特的生物活性、低毒性等，常被作為醫(yī)藥創(chuàng)制的基本結(jié)構(gòu)單元[7-9]1。為了尋找高活性的新型化合物，本研究從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的小分子化合物庫(kù)中選取13個(gè)含有哌啶并噻吩為母核，成氯鹽，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道的新型化合物，在體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞中，研究其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；并分析了化合物結(jié)構(gòu)與活性之問(wèn)可能存在的關(guān)系。對(duì)活性最高（對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率最高）的化合物進(jìn)行了抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度依賴效應(yīng)分析及對(duì)正常人胚肺成纖維MRC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院張繼紅老師饋贈(zèng)，正常人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞胞庫(kù)，小分子化合物購(gòu)自Life Chemicals。研究中所用主要試劑包括：改良型RPMI-1640培養(yǎng)藎fIIv一clone）、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、胎牛血清（Scien—Cell）、特級(jí)胎牛血清（Gibco）、青鏈霉素混合液液（So一larbio）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）、二甲基亞砜（DMSO，Solarbio）。WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出細(xì)胞，復(fù)蘇后置于6 cm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放在37 ℃、5% C02條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）中培養(yǎng)。A549細(xì)胞完個(gè)培養(yǎng)基包括改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、10%的胎牛血清（ScienCell）、1%的青鏈霉素混合液；MRC-5細(xì)胞完全培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基、15%的特級(jí)胎牛血清（Gibco）、1%的青鏈霉素混合液。復(fù)蘇后生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，傳代至10 cm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，用于小分子化合物活性檢測(cè)試驗(yàn)。

1.3 .13 個(gè)小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用分析

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)脆，接種于96孔板，鋪板密度為2xl04 cells/mL，即每孔為2000個(gè)細(xì)胞，體積為100 μL。細(xì)胞接種24h后，向其中分別加入各小分子化合物（終濃度為10μmol/L）體積為1μL，對(duì)照孔中加入等體積的DMSO（終濃度為0.5%），每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)（每個(gè)小分子及DMSO均分別處理3個(gè)孔的細(xì)胞），再補(bǔ)加細(xì)胞完全培養(yǎng)基100 μL。小分子化合物處理48 h后，每孔加入WST-1溶液20 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2～4 h，然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，所得數(shù)據(jù)用于結(jié)果分析。1.4 小分子化合物11抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度依賴效應(yīng)分析及對(duì)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用分析

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和MRC一5細(xì)胞，接種于96孔板，鋪板密度為2x104 cells/mL，即每孔為2 000個(gè)細(xì)胞，體積為100 μL。細(xì)胞接種24 h后，向其中分別加入不同濃度的化合物1 1（噻吩并[2， 3-c]哌啶-3-甲酰胺一2一[（3一甲氧基一萘-2-羰基）一氨基卜6-芐基一，鹽酸鹽；Thieno[2，3 -c] piperidine一3-carboxamide -2 -[（3 -methoxy -naphthalene -2 -carbonyl） -amino] -6 -（benzyl） -，hy-drochloride）（終濃度分別為1、2.5、5、10 μmol/L），體積為1μL，對(duì)照孔中加入等體積的DMSO （終濃度為0.5%），每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)（不同濃度的小分子及DMSO均分別處理3個(gè)孔的細(xì)胞），再補(bǔ)加細(xì)胞完全培養(yǎng)基100 μL。小分子化合物處理48 h后，每孔加入WST-1溶液20 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2～4 h，然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，所得數(shù)據(jù)用于結(jié)果分析。該化合物抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值用GraphPad Prism軟件計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 13個(gè)小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

本研究所用的13個(gè)化合物是具有相同核心結(jié)構(gòu)（圖1）的類似物，并成氯鹽。因其核心結(jié)構(gòu)含哌啶并噻吩結(jié)構(gòu)，所以我們暫時(shí)把這一類小分子命名為哌啶并噻吩類化合物。核心結(jié)構(gòu)中的R1、R2代表不同的結(jié)構(gòu)基團(tuán)?；衔?～4的Rl結(jié)構(gòu)基團(tuán)為甲氧羰基，5—8的R1結(jié)構(gòu)基團(tuán)為氰基，9～13的R1結(jié)構(gòu)基團(tuán)為氨甲?；ū?）。

用化合物（終濃度10 μmol/L）處理A549細(xì)胞48 h后，用WST-1法檢測(cè)細(xì)胞的存活情況，通過(guò)與對(duì)照細(xì)胞（DMSO）的存活情況進(jìn)行比較，來(lái)計(jì)算各化合物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（表1）。R1結(jié)構(gòu)基團(tuán)均為甲氧羰基的化合物中，對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率最高的是化合物4，抑制率為（26.58+3.65）%；R1結(jié)構(gòu)基團(tuán)均為氰基的化合物中，對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率最高的是化合物7，抑制率為（46.59+8.68）%；R1結(jié)構(gòu)基團(tuán)均為氨甲?；幕衔镏校瑢?duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率最高的是化合物11，抑制率為（71.34+0.96）%。2.2 小分子化合物11抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量效應(yīng)及對(duì)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

13個(gè)小分子化合物中對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高的化合物1 1，我們又進(jìn)行了不同濃度的化合物11對(duì)A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用分析。結(jié)果顯示，該化合物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用具有明顯的濃度依賴效應(yīng)，A549細(xì)胞的存活率隨化合物11濃度的增加而逐漸降低，在終濃度為10 μmol/L的時(shí)候，抑制率達(dá)到最大。用GraphPad Prism軟件計(jì)算出該化合物抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的1C50為2.407 μmol/l.。雖然MRC-5細(xì)胞的存活率也隨化合物11濃度的增加而有所降低，但終濃度為10 μmol/L時(shí)，其對(duì)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率也只有30.41%（圖2）。

由此可見，化合物11對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是一種特異的作用，而非簡(jiǎn)單的細(xì)胞毒性，同時(shí)該化合物對(duì)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率遠(yuǎn)小于對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，這些特征都暗示我們?cè)摶衔锘蛟S可作為治療肺癌藥物先導(dǎo)化合物來(lái)進(jìn)行藥物研發(fā)。

3 討論

A549細(xì)胞系是1972年由GJiard等從58歲的白種男性的肺腺癌組織移植，通過(guò)體外培養(yǎng)建立的細(xì)胞系，一方面具有Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的形態(tài)及特性，另一方面表現(xiàn)出典型的肺腺癌細(xì)胞惡性特征。因此，A549細(xì)胞系被廣泛用于抗肺癌藥物篩選及其他肺癌相關(guān)研究中。

本研究中，檢測(cè)細(xì)胞存活情況采用的是WST-1法。WST-1是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。首先，MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的甲瓚（formazan）不是水溶性的，需要有特定的溶解液來(lái)溶解；而WST-1和XTT、MTS產(chǎn)生的甲瓚都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟；其次，WST一1產(chǎn)生的甲瓚比XTT和MTS產(chǎn)生的甲瓚更易溶解；再次，WST-1比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使試驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-1和MTT'、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高；是體外篩選抗癌新藥的可靠方法。

含氮雜環(huán)母核的化合物一直是研究的熱點(diǎn)，但目前哌啶并噻吩類化合物研究相對(duì)較少，只有曾國(guó)平等報(bào)道9個(gè)合成的未見報(bào)道的新型哌啶并噻吩并嘧酮衍生物中，部分化合物有較好的抑制黃瓜灰霉、水稻紋枯、小麥赤霉菌生長(zhǎng)的活性，本研究所篩選的化合物是13個(gè)未見報(bào)道的哌啶并噻吩類化合物.在體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，利用W-ST-1法檢測(cè)化合物處理后細(xì)胞存活率的變化，發(fā)現(xiàn)了部分化合物能不同程度抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，其中化合物II對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效率最高，但對(duì)正常MRC-5細(xì)胞牛長(zhǎng)的抑制作用顯著低于對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，這一新的發(fā)現(xiàn)也為肺癌治療藥物的開發(fā)提供了新的思路。

通過(guò)對(duì)13個(gè)小分子化合物結(jié)構(gòu)與活性之間可能存在的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Rl結(jié)構(gòu)基團(tuán)為甲氧羰基的4個(gè)化合物中，化合物4的活性最高，化合物1、2、3活性相對(duì)較低的原因可能是R2結(jié)構(gòu)基團(tuán)相對(duì)大.導(dǎo)致空間阻力大，使得與受體結(jié)合不夠強(qiáng)：Rl結(jié)構(gòu)基團(tuán)為氰基的4個(gè)化合物中，化合物5、6、7的活性差不多，其中化合物5、6可能因?yàn)镽2結(jié)構(gòu)基團(tuán)有苯并雜環(huán)結(jié)構(gòu)，化合物7需要待一步研究；R1結(jié)構(gòu)基團(tuán)為氨甲?；?個(gè)化合物中，化合物Il的活性最高，可能因?yàn)槠銻2結(jié)構(gòu)基團(tuán)有苯并結(jié)構(gòu)及苯環(huán)結(jié)構(gòu)的完整性。化合物結(jié)構(gòu)與活性之問(wèn)關(guān)系的初步分析也為以后的化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)及計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選提供了一定的思路。

化學(xué)遺傳學(xué)（chemical genetics）是在20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)一門交叉學(xué)科。其主要思路就是利用小分子化合物來(lái)干擾細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程，從而鑒定參與這些生物過(guò)程的新的生物大分子。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)的對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用的化合物11也可用于后續(xù)的肺癌發(fā)生機(jī)制的化學(xué)遺傳學(xué)研究中。通過(guò)尋找該化合物在A549細(xì)胞巾可能作用的信號(hào)通路及作用的靶蛋白.可揭示新的肺癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，同時(shí)還可為治療肺癌的新藥研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

總的來(lái)說(shuō)，本研究發(fā)現(xiàn)了一類新的可抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子化合物，并發(fā)現(xiàn)其影響化合物活性的可能關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基團(tuán)。其中化合物11對(duì)肺癌_A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，但對(duì)正常MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較低，是一個(gè)較理想的新的治療肺癌的藥物先導(dǎo)化合物。此外，化合物11還可用于肺癌發(fā)生機(jī)制的化學(xué)遺傳學(xué)研究，可發(fā)現(xiàn)一些新的針對(duì)肺癌的藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。