馬 慧 茍亞峰 劉鵬濤 高劍峰

摘要：通過布魯氏菌（BrUcella） 16M（強(qiáng)毒株）和M5（弱毒株）進(jìn)入小鼠巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，結(jié)合布魯氏菌胞內(nèi)生存能力分析二者侵染小鼠巨噬細(xì)胞過程的差異，為布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。將綠色熒光蛋白（green fluoreseent prolein. GFP）布魯氏菌16M（強(qiáng)毒株）和M5 f弱毒株）分不同時(shí)間段侵染小鼠巨噬細(xì)胞（感染復(fù)數(shù)為100：1），通過胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)、激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)布魯氏菌侵入RAW 264.7過程的差異 結(jié)果表明，布魯氏菌16M和M5和GFP的l6M和M5侵染RAW264.7的能力不受影響，通過流式細(xì)胞儀可以鑒別CFP布魯氏菌，但是不能確定細(xì)菌的存活狀。 結(jié)合布魯氏菌16M和M5胞內(nèi)生存能力分析發(fā)現(xiàn)CFP+細(xì)胞的增加與活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（colony forming unit，CGU）數(shù)量的減少存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，并且在侵染初期（5～25 min） 16M與M5的熒光強(qiáng)度并沒有顯著差異。 結(jié)果提示，布魯氏茵16M和M5在侵染進(jìn)入宿主細(xì)胞的初期即侵襲能力并沒有明顯差異.認(rèn)為造成毒力差異的主要原因是兩者的繁殖能力。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌；綠色熒光蛋白（CFP）；小鼠巨噬細(xì)胞；激光共聚焦顯微鏡：流式細(xì)胞儀

中圖分類號(hào)：Q38

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）05-0401-06

布魯氏菌屬于革蘭氏陰性胞內(nèi)菌，可以對(duì)人類和家畜造成嚴(yán)重的慢性感染。人若患有此病會(huì)經(jīng)常發(fā)高燒.精神萎靡，嗜睡，關(guān)節(jié)炎和脾腫大。在反芻動(dòng)物中，布魯氏菌病可導(dǎo)致流產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌沒有典型的外毒素、Ⅲ型分泌系統(tǒng)等毒力元件，其毒力主要表現(xiàn)在侵襲力和繁殖力。作為胞內(nèi)寄生菌.它們既能在小鼠巨噬細(xì)胞生存，也能在非巨噬細(xì)胞（如滋養(yǎng)層細(xì)胞，上表皮細(xì)胞等）中生存，并且可以引起天然宿主網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)持續(xù)性感染。因此了解布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機(jī)制是理解布魯氏菌致病性的關(guān)鍵。布魯氏菌強(qiáng)毒株16M和疫苗株M5是兩種典型胞內(nèi)寄生菌，同屬布魯氏菌I型標(biāo)準(zhǔn)菌株，進(jìn)入宿主后，能以不同方式逃避巨噬細(xì)胞的殺滅并在細(xì)胞內(nèi)生存、繁殖，還能逃避體液免疫和抗生素的殺滅作用，使巨噬細(xì)胞反而成為庇護(hù)所，導(dǎo)致臨床治療困難。但就日前來說，對(duì)布魯氏菌進(jìn)入宿主胞內(nèi)和繁殖機(jī)制還有很多未知。因此，通過含有GFP的載體pMC-221電轉(zhuǎn)進(jìn)入布魯氏菌16M和M5，利用GFP布魯氏菌侵染RAW 264.7進(jìn)行流式細(xì)胞和胞內(nèi)生存能力分析，對(duì)布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細(xì)胞過程的侵襲力和繁殖力比較，分析導(dǎo)致兩者毒力差異的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種、細(xì)胞系和載體

布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株16M和弱毒株M5、RAW 264.7系由新疆石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存。載體pMC-221由美國威斯康星大學(xué)Jerome S.Harms博士惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

布魯氏菌液體和固體培養(yǎng)基均購白美國BD公司； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司：丙三醇、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、過氧化氫均為國產(chǎn)試劑；PCR儀（Techne、Bl0 -RAD、Biometra）； UV凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）；超速離心機(jī)（Eppenclorf， centrifuge -5415D）；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162）；恒溫?fù)u床（7HWY-2102C），高速冷凍離心機(jī)（Sigma，2-16K）；常溫離心機(jī)（Beickmanmi-crofuge16、Thermo PC21）；水浴鍋（DKB-501A）；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌罐；超低溫冰箱；電泳儀：超凈工作臺(tái)；去離子水儀器（Thermo）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162型、EYELA SLI～700）；電轉(zhuǎn)儀（Eppen-dorr eporator）；電擊杯（eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌16M和M5的培養(yǎng)

將布魯氏菌16M和M5接種到布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，封口置于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取單菌落置于20 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，置于37℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3～4d。

1.2.2 布魯氏菌16M和M5電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取布魯氏菌16M和M5單菌落.分別至20 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；轉(zhuǎn)接50 μL菌液至100 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～18 h，取94μl_的菌液至無菌EP管中，取出布魯氏菌16M和M5的菌液冰上放置30 min，期間搖動(dòng)幾次，保證冷卻均勻；4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，收菌；用20 mL預(yù)冷的去離子水重懸浮菌體，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，倒掉上清；重復(fù)卜一步3次；加入預(yù)冷的15 %甘油，加入的量為濃縮60～80倍；重懸菌體，分裝，每管100 μL，置于-80℃保存。

1.2.3 電擊轉(zhuǎn)化

取pMC-221質(zhì)粒f41（圖1）9μL加入布魯氏菌感受態(tài)細(xì)胞中，吹打混勻，冰上靜置15 min，轉(zhuǎn)移至l mm電擊杯中，電擊參數(shù)為1.8 kV/mm， 4.5 ms，1次脈沖。電擊完成后立即加入37℃預(yù)熱的900 μL的布魯氏菌液體培養(yǎng)基，吹打均勻，轉(zhuǎn)移到1.5 mLEP管中，封口膜封口，置于37 ℃， 180 r/min培養(yǎng)24 h。常溫8 000 r/min離心2 min收菌，重懸菌體，涂布于氯霉素抗性的布魯氏菌同體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，挑出單菌落。挑取單菌落至含有1mL的布魯氏菌液體培養(yǎng)基的EP管中，置于37℃ 、180 r/min振蕩培養(yǎng)24h。取100μL菌液至1 mL的EP管中85 ℃金屬浴滅活1 h。菌液PCR鑒定陽性克降菌。

1.2.4 巨噬細(xì)胞系RAW264.7培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)

無菌條件下將細(xì)胞瓶?jī)?nèi)小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)2.5%胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至6孔板中，孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液加至4mL，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱，5% C02、37℃，24 h半量換液，培養(yǎng)2 d，備用。取六孔板中1孔，用300 μL 2.5%胰酶消化2 min，加1 mL培養(yǎng)液，用吸管吹打至完傘脫落，收集至1.5 mL離心管，2 000r/min離心2min，棄上清，加入lmL PBS，取10 μL至另一含90 μL PBS的1.5 mL離心管，稀釋混勻，取10μL懸液滴在計(jì)數(shù)板上，細(xì)胞計(jì)數(shù)。1.2.5 布魯氏茵16M和M5侵染小鼠巨噬細(xì)胞和菌液計(jì)數(shù)

取lμL經(jīng)計(jì)數(shù)的菌液于50 mL離心管中，3 min 12 000 r/min，PBS洗3次，然后加19 mL無雙抗、含10%胎牛血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸。按照布魯氏菌與RAW 264.7的比例為100：1，麥?zhǔn)媳葷嶂了铦舛?，稀釋? mL重懸細(xì)菌液。棄去六孔板中舊完全培養(yǎng)基，加入重懸細(xì)菌液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%CO2、37 ℃條件下分別培養(yǎng)5、10、20、30 min、I、1.5、2、2.5、6、12、24、48 h取出六孔板，PBS洗3遍，加入2 mL含20/c雙抗、10%胎牛血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。

1.2.6 布魯氏菌16M和M5的胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)

RAW 264.7傳代至六孔板，分別編為16M組、M5組、GFP-16M組、CFP-M5組。培養(yǎng)至鋪滿六孔板底部，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將布魯氏菌16M和M5接種到20 mL的布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，180r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。收菌，PBS反復(fù)重懸浮菌體。依照1.2.5步驟計(jì)算出的細(xì)胞與細(xì)菌比例

將布魯氏菌加入到六孔板中，置于CO2濃度為5.0，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。侵染l h之后六孔板中每孔加入2.5μL慶大霉素作用45 min，儀染4、8、12 h之后的小鼠巨噬細(xì)胞用PBS清洗3次，每次5 min；收集細(xì)胞接種密度為lxl0個(gè)，之后加入0.2%細(xì)胞裂解液lmL，用移液器將RAW264.7完全吹打混勻，釋放出胞內(nèi)菌。然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，冰浴處理5 min；然后按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，移液器吹打均勻，然后每個(gè)梯度取100μL，均勻涂布至無抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，3～4 d，記錄平皿中細(xì)菌的數(shù)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 布魯氏菌16M和M5侵染RAW 264.7的激光共聚焦顯微鏡試驗(yàn)

將RAW 264.7傳代至六孔板（蓋玻片置于每孔中），分別編為Brucella組和過氧化氫Brucella組（蓋玻片以備置于每孔中）每孔3 mL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5% C02、37℃條件下過夜培養(yǎng)（激光共聚焦顯微鏡試驗(yàn)中平鋪在六孔板的數(shù)量最好維持在（1～lO）xl0 5/mL為最佳，細(xì)胞數(shù)量較多，平鋪在6孔板中形成層疊，造成熒光重疊，對(duì)熒光觀測(cè)有一定影響）。次日在六孔板中將已爬好細(xì)胞玻片用PBS浸洗3次，加入無雙抗的培養(yǎng)液，備用；取1 mL經(jīng)麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尩木杭尤朊靠字校秩緯r(shí)間分別為4 h：侵染完成后在過氧化氫Brucella組中加入過氧化氫.取出細(xì)胞爬片蓋向滴有70%甘油的載玻片上，制片完成放入保濕盒，用于共聚焦顯微鏡觀測(cè).每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 羊布魯氏菌16M和M5侵染RAW 264.7的流式細(xì)胞儀試驗(yàn)

將RAW 264.7加入六孔板，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%CO2、37℃條件下過夜培養(yǎng)。次日取l mL經(jīng)麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尩木杭尤朊靠字校秩緯r(shí)間分別為5 .10、15、20、25 min、6、12、24、48 h，根據(jù)侵染時(shí)問依次加入PBS吹打細(xì)胞收集放入1.5 mLEP管中，離心3min 12 000 r/min，去除PBS加入4%多聚甲醛和慶大霉素2.5μL吹打混勻，靜止30 min，在侵染1 h后加入2.5μL，慶大霉素為了防止殘留在胞外的細(xì)菌侵染細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。之后用于流式細(xì)胞儀分析試驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌侵染之前RAW 264.7和茵量的計(jì)數(shù)結(jié)果

根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法得到細(xì)胞lxlO11/mL.按照細(xì)菌與細(xì)胞的MOI為100：1別需要細(xì)菌lxlO 8。利用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒉剪斒暇葷嵯♂屩?×lO8/mL。

2.2 布魯氏菌侵染RAW 264.7激光共聚焦顯微鏡試驗(yàn)結(jié)果

按照?qǐng)D2A中顯示結(jié)果來看，布魯氏菌侵染進(jìn)入RAW 264.7后產(chǎn)生CFP綠色熒光蛋白，未進(jìn)入胞內(nèi)的布魯氏菌在胞外不產(chǎn)生綠色熒光。圖2B結(jié)果顯示來看，加入過氧化氫的目的是使小鼠巨噬細(xì)胞破裂死亡并殺死胞內(nèi)布魯氏菌，但是發(fā)現(xiàn)GFP沒有因?yàn)镽AW 264.7破裂被釋放和伴隨著布魯氏菌的死亡而熒光強(qiáng)度受到影響。2.3 16M和M5侵染小鼠小鼠巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)生存能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞0～12 h的胞內(nèi)菌CFU計(jì)數(shù).從圖3A、B可以看出，CFP布魯氏菌16M和M5對(duì)比正常布魯氏菌16M和M5在胞內(nèi)生仔能力方面并沒有影響。因此，GFP基因的整合重組并不會(huì)影響布魯氏菌本身的生物特性。

2.4 16M和M5侵染小鼠巨噬細(xì)胞0—48 h流式細(xì)胞儀檢測(cè)

圖4A中結(jié)果得知含有GFP的布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細(xì)胞264.7在6—24 h內(nèi)GFP+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增長迅速，證明是細(xì)胞免疫強(qiáng)烈階段、 24～48 h增長趨于平緩。圖4B中我們可以看出在0—24 h之問CFU數(shù)量減少，24～48 h后逐漸增加。圖3A、B結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)GFP+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與CFU數(shù)量在0～48 h之問有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，圖3A實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出流式細(xì)胞儀通過GFP+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，反映含有GFP布魯氏菌16M和M5進(jìn)入小鼠巨噬細(xì)胞264.7的數(shù)量，但不能確定GFP布魯氏菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后的存活狀態(tài)，但通過胞內(nèi)菌CFU計(jì)數(shù)，可以很好地彌補(bǔ)這一點(diǎn)。

2.5 16M和M5侵染初期小鼠巨噬細(xì)胞5—25min流式細(xì)胞儀檢測(cè)

圖5表示細(xì)菌侵染細(xì)胞的初級(jí)階段，5 min時(shí)GFP+細(xì)胞數(shù)量少且可忽略不計(jì)，10 min時(shí)GFP+細(xì)胞逐漸增多但布魯氏菌16M和M5之間的差異并不明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無顯著性差異（P>0.05），得知在侵染初期（5～25 min之內(nèi)）布魯氏菌16M和M5進(jìn)入小鼠巨噬細(xì)胞的數(shù)量大致相同。

3 討論

布魯氏菌16M和M5雖同為I型布魯氏菌，但至今對(duì)其致病機(jī)制沒有更為深入的研究，目前，國內(nèi)外主要集中在布魯氏菌毒力因子和宿主因子的篩選及功能研究上，缺乏對(duì)布魯氏菌16M和M5侵入、胞內(nèi)存活、復(fù)制等過程的認(rèn)識(shí)和差異比較。因此，本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀對(duì)熒光的高敏感性，將含有GFP的布魯氏菌16M和M5劃分不同時(shí)間段侵染RAW 264.7得到的結(jié)果進(jìn)行差異比較，經(jīng)研究證實(shí)含有GFP的布魯氏菌與不含有GFP的布魯氏菌在侵染細(xì)胞和進(jìn)入宿主細(xì)胞后生仔及繁殖能力上相同，因此用含有GFP的布魯氏菌來侵染小鼠巨噬細(xì)胞不會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們得知0～24 h布魯氏菌侵染細(xì)胞使得GFP+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增長迅速，之后便達(dá)到飽和狀態(tài)，增長緩慢；但通過CFU計(jì)數(shù)得知0—24 h布魯氏菌16M和M5在胞內(nèi)存活數(shù)量下降了15倍之多，說明大部分布魯氏菌并沒有逃脫內(nèi)吞作用 24—48 h后細(xì)菌在胞內(nèi)繁殖使得數(shù)量增加，但胞內(nèi)布魯氏菌16M與M5的數(shù)量差距也在不斷增大。之后通過流式細(xì)胞儀測(cè)定儀染初期5—25 min時(shí)發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌16M和M5進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量差距并不明顯，反映出布魯氏菌16M與M5進(jìn)入細(xì)胞的侵入能力相同但胞內(nèi)存活和復(fù)制的能力16M強(qiáng)于M5，因此認(rèn)為二者產(chǎn)生差異的原因豐要是與胞內(nèi)存活與復(fù)制有關(guān)。