汪偉偉 劉菊 蔣雪麗 張森 方博文 劉偉 黃宏平 汪萌芽

摘 要：為比較不同傷害性刺激致大鼠痛感覺(jué)與痛情緒的差異，對(duì)17只麻醉SD大鼠進(jìn)行痛感覺(jué)代表腦區(qū)異顆粒區(qū)（dysgranular zone，DZ）和痛情緒代表核團(tuán)基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala，BLA）電活動(dòng)，與心電、呼吸肌肌電、皮膚電導(dǎo)、體溫的同步心理生理學(xué)記錄，按順序均衡法分別給予熱、夾尾和電刺激觀察到熱和夾尾刺激增強(qiáng)BLA和DZ.而電刺激僅增強(qiáng)DZ的放電活動(dòng)，且熱刺激所誘發(fā)的BLA與DZ放電活動(dòng)均強(qiáng)于夾尾和電刺激所誘發(fā)的活動(dòng)（P<0.05）。BLA與SZ的基礎(chǔ)放電頻率呈正相關(guān)（P<0.05），夾尾刺激后相關(guān)性增高（P

關(guān)鍵詞：傷害性刺激：痛感覺(jué)；痛情緒；異顆粒區(qū)（DZ）；基底外側(cè)杏仁核（BLA）

中圖分類(lèi)號(hào)：R441.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）05-0411-07

世界衛(wèi)生組織將疼痛確定為繼血壓、呼吸、脈搏、體溫之后的“第五大生命體征”，但疼痛的心理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚。1994年國(guó)際疼痛研究會(huì)（international assoCiation for the study pain， IASP）將疼痛定義為：“一種組織損傷或潛在損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺(jué)和情緒體驗(yàn)”。此定義說(shuō)明疼痛包括痛感覺(jué)和痛情緒兩方面。疼痛發(fā)生過(guò)程中既有痛感覺(jué)傳導(dǎo)通路又有痛情緒的傳導(dǎo)通路，以往在研究大鼠接受不同傷害性刺激時(shí)腦內(nèi)核團(tuán)的腦電活動(dòng)變化存在相似和不同的爭(zhēng)議。究其原因可能還是各研究者在核團(tuán)及傷害性刺激種類(lèi)選取上存在差異所致。在猴的研究中已表明傷害性刺激會(huì)特異性引起第一軀體感覺(jué)皮層中的3a區(qū)域發(fā)生反應(yīng)，在后續(xù)研究中又發(fā)現(xiàn)大鼠腦中異顆粒區(qū)（dysgranular zone，DZ）與猴腦中3a區(qū)域具有類(lèi)似的功能，但不同傷害性刺激在大鼠DZ區(qū)域是否誘發(fā)差異性反應(yīng)，尚未見(jiàn)報(bào)道。已有文獻(xiàn)報(bào)道，痛情緒反應(yīng)過(guò)程中基底外側(cè)杏仁核（baso-lateral amygdala，BLA）起到非常重要的作用。另外，在人類(lèi)情緒的心理生理學(xué)研究中也特別重視對(duì)情緒相關(guān)的自主性生理反應(yīng)的觀察，因?yàn)檫@些自主性生理變化和情緒之間存在著顯而易見(jiàn)的聯(lián)系。如研究表明，心率、皮膚電反應(yīng)、血壓等都是反映情緒變化的有效指標(biāo)。疼痛往往伴有抑郁情緒的發(fā)生，在有抑郁癥狀的患者中有大部分同時(shí)具有疼痛癥狀。同時(shí)神經(jīng)解剖學(xué)證明，很多參與疼痛形成的腦區(qū)，同時(shí)也參與自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。為此，利用心理生理學(xué)技術(shù)，給予大鼠不同傷害性刺激（熱刺激、夾尾刺激、電刺激），采集疼痛過(guò)程中的核團(tuán)放電、呼吸肌肌電、體溫、心電、皮膚電導(dǎo)等指標(biāo)來(lái)反映疼痛過(guò)程中的痛感覺(jué)和痛情緒的發(fā)生過(guò)程，觀察和比較痛情緒代表核團(tuán)BLA和痛感覺(jué)代表核團(tuán)DZ的放電活動(dòng)及其相關(guān)性，以及各項(xiàng)外周生理指標(biāo)變化的異同。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用250—300 g成年SD雄性大鼠17只，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.2 儀器設(shè)備及藥品

常規(guī)動(dòng)物手術(shù)器械如血管鉗式夾尾儀、電針、溫度計(jì)，雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩和防震臺(tái)，腦立體定位儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）、手術(shù)顯微鏡、牙科鉆和保溫毯。不銹鋼同芯金屬電極、金屬參考電極和微電極放大器，PowerLab八通道生理信號(hào)采集與處理系統(tǒng)（PowerLab System，AD Instruments，Australia）及其Chart Pro記錄和分析軟件，20%氨基甲酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、75%醫(yī)用酒精（德州安捷高科消毒制品有限公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物麻醉

術(shù)前晚給實(shí)驗(yàn)大鼠禁水禁食處理，1.5 mL/kg20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉穩(wěn)定后將大鼠固定于腦立體定位儀，下墊恒溫37.O℃保溫毯，放置在雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩內(nèi)的防震臺(tái)上。

1.3.2 多項(xiàng)生理指標(biāo)記錄

將針式電極插入大鼠右前肢腕關(guān)節(jié)上部的前臂皮下，左后肢踝關(guān)節(jié)上部的小腿皮下，右后肢接地，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在大鼠肛門(mén)內(nèi)放置體溫?fù)Q能器探頭并用醫(yī)用膠布同定，進(jìn)行體溫信號(hào)采集。以2根針式電極插人大鼠右側(cè)腋中線第9肋下緣肋間外肌內(nèi)，記錄呼吸肌肌電圖。將兩塊板式皮膚電導(dǎo)電極，用醫(yī)用膠布分別固定于大鼠左前掌背面和腹面，記錄皮膚電導(dǎo)信號(hào)。

1.3.3 腦部雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄

調(diào)節(jié)耳桿使左右對(duì)稱，上下移動(dòng)門(mén)齒桿使大鼠顱骨處于同一水平面，固定大鼠頭部使之不能移動(dòng)。用手術(shù)刀切開(kāi)頭皮，3%H202擦拭充分止血，暴露顱骨標(biāo)志（前囟、人字縫）。調(diào)節(jié)前囟、人字縫到同一水平平面。定位：異顆粒區(qū)（DZ）：前囟后（AP），0.48—-3.3 mm；旁開(kāi)（L），3.5～4.6 mm；硬膜表面以下（DV），0.8—3.0 mm；基底外側(cè)杏仁核（BLA）：前囟后（AP），-1.56—-3.36 mm；旁開(kāi)（R），3.9～4.6mm；硬膜表面以下（DV），7.8—8.82 mm。用牙科鉆鉆顱開(kāi)窗，手術(shù)顯微鏡下用顯微剪剪開(kāi)硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜，3% H202充分止血。使用金屬電極在操作臂的牽引下移至顱窗上，并緊貼腦組織，2%生理鹽水瓊脂封窗。安置好參考電極、接地電極。記錄電極接人記錄放大系統(tǒng)。操縱電極下至目標(biāo)腦區(qū)后，尋找合適、明確的細(xì)胞外放電信號(hào)，待BLA、DZ及各項(xiàng)生理指標(biāo)信號(hào)穩(wěn)定后，記錄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)20 min并存盤(pán)。

1.3.4 傷害性刺激

熱刺激：將大鼠尾部8—10 cm放入50 ℃水中，3s后取出尾部，持續(xù)觀察并作記錄。夾尾刺激：使用充分絕緣后的血管鉗夾持大鼠尾巴后1/3處，以后肢抽動(dòng)為適宜強(qiáng)度，5s后撤離刺激，持續(xù)觀察并記錄。電刺激：將刺激電極插入大鼠尾巴后1/3處，給予9 Hz， 200卜μs，5 mA恒流刺激，持續(xù)觀察并記錄。采用排列組合的方法進(jìn)行刺激順序均衡，安排給予同一大鼠的不同傷害性刺激。刺順序有6幣種方案：HTE、HET、THE、TEH、E—HT、ETH （H： Thermal stimulus；T：Tailpinch；E：Electrical stimulation）。各大鼠隨機(jī)按其中一組刺激方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每種刺激記錄刺激前20 min到刺激后40 min的信號(hào)。

1.3.5 信號(hào)采集參數(shù)設(shè)置

記錄電極所引導(dǎo)和記錄的信號(hào)經(jīng)放大器，進(jìn)入PowerLab多導(dǎo)生理信號(hào)采集與處理系統(tǒng)，由計(jì)算機(jī)中Chart軟件進(jìn)行采集、存盤(pán)，采樣頻率10 kHZ，各通道參數(shù)設(shè)置如下：BLA、DZ腦電信號(hào)高通10 Hz、低通2 kHz.體湍信號(hào)低通10 Hz，心電信號(hào)高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌電信號(hào)高通0.1 Hz、低通200 Hz，皮膚電導(dǎo)信號(hào)量程設(shè)為l0μS。

1.3.6 記錄位點(diǎn)鑒定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，斷頭處死大鼠并取腦，置于4%甲醛溶液內(nèi)固定后做冠狀而切片，觀察針道位置與圖譜BLA、DZ的位置進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行記錄位點(diǎn)鑒定。

1.4

數(shù)據(jù)分析

I.4.1 記錄信號(hào)的分析

記錄到的腦內(nèi)核團(tuán)放電活動(dòng)信號(hào)、各項(xiàng)生理指標(biāo)信號(hào)，分別使用Charl Pro系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量和分析。分析細(xì)胞外記錄的核團(tuán)電活動(dòng)的放電頻率直方圖反映核團(tuán)電活動(dòng)的頻率及其放電活動(dòng)的特點(diǎn)。幅值為選定時(shí)問(wèn)的每2 s內(nèi)信號(hào)幅度最大值減去最小值的平均值。呼吸肌肌電周期計(jì)算，使用Chart Pro軟件中周期測(cè)量（cyclic mea-suUrements）功能，濾波設(shè)為高通150 Hz、最小周期與最小峰高S.D.按數(shù)據(jù)模擬的準(zhǔn)確程度適當(dāng)調(diào)整，將數(shù)據(jù)添加到數(shù)據(jù)板，可自動(dòng)算出均數(shù)，即為平均肌電周期或用直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各數(shù)據(jù)結(jié)果均以x±s表示，兩組均數(shù)差異的比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)差異的比較用單因素方差分析，相關(guān)性分析用直線相關(guān)和直線回歸分析。P<0.05為差異有顯著性意義。

2

結(jié)果

2.1 腦內(nèi)BLA、DZ電活動(dòng)和多項(xiàng)生理指標(biāo)同步記錄

典的痛情緒、痛感覺(jué)反應(yīng)代表核團(tuán)BLA、DZ放電信號(hào)和心電、體溫、呼吸肌肌電、皮膚電導(dǎo)等各項(xiàng)生理指標(biāo)穩(wěn)定記錄例示于圖1。各信號(hào)均穩(wěn)定的13只大鼠前20 min正常六通道記錄數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析顯示.其BLA和DZ核團(tuán)相關(guān)性r=0.646，P=0.017，表明兩核團(tuán)放電頻率呈正相關(guān)?；A(chǔ)記錄20 min的BLA腦電幅值（295.26+78.50）μV、DZ腦電幅值（143.61±52.65）μV、體溫（37.11±0.67）℃、皮膚電導(dǎo)（0.20+0.18）μS、心率（361.28±24.71） bpm、R波幅度（422.80±145.27）μV、呼吸肌電幅值（81.04±31.52） μV、呼吸肌電平均周期（0.91+0.05）s，與前期報(bào)道文章相似。

2.2

熱刺激誘發(fā)的反應(yīng)

2.2.1 熱刺激對(duì)BLA、DZ電活動(dòng)的影響

對(duì)17只給予熱刺激實(shí)驗(yàn)的大鼠進(jìn)行BLA、DZ放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示其中有10只大鼠在刺激后有BLA、DZ放電頻率增高反應(yīng)，典型結(jié)果例示于圖2，其余大鼠未誘發(fā)出此類(lèi)現(xiàn)象，對(duì)此10只大鼠的熱刺激前2 min、熱刺激引起的峰反應(yīng)時(shí)、峰反應(yīng)后2min的BLA放電頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖2A），可以看到反應(yīng)時(shí)BLA放電頻率相對(duì)刺激前有顯著性增加（P<0.01），反應(yīng)后相對(duì)反應(yīng)時(shí)放電頻率恢復(fù)（P<0.01）。同樣對(duì)DZ腦電進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，圖2B顯示反應(yīng)時(shí)DZ放電頻率棚對(duì)刺激前有顯著性增加（P

2.2.2 熱刺激對(duì)各生理指標(biāo)的影響

分析此10只大鼠在熱刺激前、刺激時(shí)、刺激后呼吸肌肌電頻率，結(jié)果顯示刺激時(shí)較刺激前人鼠呼吸頻率增快（圖3A，P0.05）。

2.3 夾尾刺激誘發(fā)的反應(yīng)

2.3.1 夾尾刺激對(duì)BLA、DZ電活動(dòng)的影響

對(duì)17只夾尾刺激大鼠進(jìn)行BLA、DZ放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示在夾尾刺激后共有8只大鼠BLA、DZ出現(xiàn)放電頻率增高反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明（圖4），反應(yīng)時(shí)BLA、DZ放電頻率相對(duì)刺激前有明顯增加（BLA：P

2.3.2 夾尾刺激對(duì)各生理指標(biāo)的影響

分析此8只大鼠在夾尾刺激前、刺激時(shí)、刺激后呼吸肌肌電頻率，結(jié)果顯示刺激時(shí)較刺激前大鼠呼吸頻率增快（圖5A，P<0.05），刺激后又恢復(fù)到原來(lái)水平（P<0.051。8只大鼠的心電分析顯示，夾尾刺激誘發(fā)大鼠心跳加快（P0.05）。

2.4 電刺激誘發(fā)的反應(yīng)

2.4.1 電刺激對(duì)BLA、DZ電活動(dòng)的影響

對(duì)17只大鼠電刺激前2 min和電刺激后2min數(shù)據(jù)進(jìn)行放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示有15只大鼠核團(tuán)放電頻率刺激后相對(duì)刺激前有所增加（圖6，BLA：P=0.072， DZ： P<0.05），其余2只大鼠未誘發(fā)此類(lèi)反應(yīng)。選取15只大鼠在電刺激后2 min的BLA和DZ放電頻率作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示r=0.348， P=0.204，說(shuō)明相關(guān)性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，較基礎(chǔ)值相關(guān)性有所降低。

2.4.2 電刺激對(duì)各生理指標(biāo)的影響

分析此15只大鼠在電刺激前、后呼吸肌肌電頻率，結(jié)果顯示呼吸頻率幾乎沒(méi)變化（圖7A，，P=0.712）。心電分析（圖7B）顯示，刺激后大鼠心跳加快（P<0.01），之后未恢復(fù)到刺激前狀態(tài)（反應(yīng)時(shí)、反應(yīng)后：P>0.05；反應(yīng)前、反應(yīng)后：P<0.05），體溫和皮膚電導(dǎo)分析后亦兀明顯變化（P>0.05）。

2.5 不同傷害性刺激影響腦內(nèi)BLA、DZ電活動(dòng)的比較

2.5.1 影響B(tài)LA電活動(dòng)的比較

計(jì)算8只大鼠BLA放電頻率在不同傷害性刺激下反應(yīng)時(shí)相對(duì)于刺激前的變化率，將各種刺激引起變化率的差異進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示3種傷害性刺激引起B(yǎng)LA放電頻率的改變有差異（表1，One -way ANOVA，F(xiàn)=4.814，P<0.05），兩兩比較結(jié)果顯示.8只大鼠熱刺激BLA放電變化率高于夾尾刺激的變化率（P=0.02）和電刺激的變化率（P=0.01），說(shuō)明50 ℃熱刺激比夾尾刺激、電刺激更易誘發(fā)明顯的BLA放電頻率的變化，而夾尾刺激和電刺激之間BLA放電頻率變化沒(méi)有顯著性差異（P=0.763）。

2.5.2 影響DZ電活動(dòng)的比較

計(jì)算8只大鼠DZ放電頻率在不同傷害性刺激下反應(yīng)時(shí)相對(duì)于刺激前的變化率，將各種刺激的變化率的差異進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示3種傷害性刺激引起DZ放電頻率亦有差異（表l，One-way ANOVA，F(xiàn)=5.740，P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，8只大鼠熱刺激引起的DZ放電頻率變化率高于夾尾刺激誘發(fā)的變化率（P=0.028）和電刺激的變化率（P=0.004），由此說(shuō)明熱刺激比夾尾刺激、電刺激更易誘發(fā)明顯的DZ放電頻率的變化。同樣，夾尾刺激和電刺激之間DZ放電頻率變化也沒(méi)有顯著性的差異（P=O.361）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在大鼠進(jìn)行腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄和多導(dǎo)生理指標(biāo)同步記錄基礎(chǔ)上，選擇了熱刺激、夾尾刺激、電刺激作為誘發(fā)疼痛的手段.腦內(nèi)記錄區(qū)域選擇了與疼痛過(guò)程中密切相關(guān)的痛情緒代表核團(tuán)BLA和痛感覺(jué)代表區(qū)域DZ，在同步記錄大鼠在痛覺(jué)過(guò)程中腦內(nèi)BLA和DZ放電活動(dòng)的變化的同時(shí)，觀察反映情緒的生理指標(biāo)。結(jié)果顯示不同傷害性刺激均可在三方面記錄指標(biāo)上產(chǎn)生顯著性影響。表明本實(shí)驗(yàn)技術(shù)不僅能夠檢測(cè)在傷害性刺激的作用下中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛感覺(jué)代表區(qū)域和痛情緒的代表核團(tuán)的放電頻率，還能將反映情緒的外周生理指標(biāo)一并分析，形成了一個(gè)綜合的痛覺(jué)記錄系統(tǒng)，是一種可行的心理生理學(xué)研究的技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)所用的傷害性刺激方案參照各類(lèi)文獻(xiàn)的做法，每種傷害性刺激為引起大鼠發(fā)生痛反應(yīng)的閾值刺激，從而使得傷害性刺激之問(wèn)具有可比性。對(duì)不同傷害性刺激下的中樞腦電發(fā)放情況進(jìn)行了一系列分析。結(jié)果表明，大鼠在接受熱刺激和夾尾刺激后痛感覺(jué)代表區(qū)域DZ和痛情緒代表核團(tuán)BLA腦電活動(dòng)都較反應(yīng)前有大幅度的增加，一段時(shí)問(wèn)后又恢復(fù)到之前的水平。而電刺激后，痛感覺(jué)的代表區(qū)域DZ腦電頻率反應(yīng)時(shí)較反應(yīng)前有明顯增加；而代表痛情緒的腦部核團(tuán)BLA腦電頻率增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可以看出，電刺激誘發(fā)的BLA放電沒(méi)有熱刺激和夾尾刺激強(qiáng)，推測(cè)可能是處理情緒的中楸對(duì)熱刺激和機(jī)械性刺激（夾尾）更加的敏感，更易產(chǎn)生反應(yīng)。為深入探討不同種傷害性刺激之問(wèn)所誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)電活動(dòng)的差異，本實(shí)驗(yàn)采用的單因素方差分析（One-way ANOVA）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱刺激、夾尾刺激、電刺激之問(wèn)的痛感覺(jué)和痛情緒反應(yīng)是具有顯著性差異的，說(shuō)明中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)疼痛處理過(guò)程是不相同的。由此，本文所采用的實(shí)驗(yàn)方法可以很好地鑒別出不同種傷害性刺激，即說(shuō)明不同種傷害性刺激所誘發(fā)的痛感覺(jué)和痛情緒的中樞代表區(qū)域的電活動(dòng)是有差異的。各種刺激后腦內(nèi)BLA、DZ核團(tuán)電活動(dòng)的相關(guān)性都有所改變，表明各種傷害性刺激后使得痛感覺(jué)、痛情緒反應(yīng)代表核團(tuán)之問(wèn)的相互關(guān)系發(fā)生了一定的改變，尤其是央尾刺激后兩核團(tuán)之間的相關(guān)性，南此提示夾尾傷害性刺激后，可能導(dǎo)致痛感覺(jué)和痛情緒之問(wèn)的聯(lián)系程度更加緊密，但是具體發(fā)生的機(jī)制需進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)，同時(shí)檢測(cè)的外周生理指標(biāo)能夠反映大鼠情緒的變化，從而可以探討外周情緒指標(biāo)與反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛情緒指標(biāo)BLA腦電活動(dòng)之間的關(guān)系。有趣的是在不同種傷害性刺激后，大鼠的心率都發(fā)生了很大程度的變化，呼吸肌肌電頻率在熱刺激和夾尾刺激都發(fā)生了相似性的反應(yīng)，電刺激并未誘發(fā)出呼吸肌肌電頻率的變化。單因素方差分析得到的結(jié)果有力證明了不同傷害性刺激所誘發(fā)的BLA放電活動(dòng)是不相同的，但從3組實(shí)驗(yàn)來(lái)看，除了電刺激時(shí)呼吸肌肌電變化不明顯，外周反映情緒的其他指標(biāo)都有相似的變化。同時(shí)，電刺激過(guò)程中BLA放電活動(dòng)沒(méi)有發(fā)生顯著性變化，呼吸肌肌電頻率也沒(méi)有顯著性變化，推測(cè)代表中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛情緒指標(biāo)（BLA電活動(dòng)）與呼吸肌肌電有密切的聯(lián)系，而是否與心率的關(guān)系也密切，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。體溫、皮膚電導(dǎo)在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并未表現(xiàn)出很明顯的變化，究其原因可能在給予大鼠麻醉后，相關(guān)神經(jīng)中樞或調(diào)節(jié)機(jī)制受抑，故對(duì)外界的傷害性刺激未做出特征性反應(yīng)。