馬領(lǐng)弟 秦 誼 朱 輝 張惠芬 何 靜 李 順 李寶才

摘 要：初步研究了褐煤精華液（brown coal distillate，BCD）溶液的組成成分及其對小麥種子萌發(fā)的影響。用不同濃度的BCD處理小麥種子煙農(nóng)19和魯原301，在無鹽脅迫和125 mmol/L NaCl脅迫條件下培養(yǎng)小麥3 d后測定種子發(fā)芽率、胚芽鞘的相對伸長速率、質(zhì)量、滲透調(diào)節(jié)能力、丙二醛含量及胚根質(zhì)量。結(jié)果顯示，BCD能促進小麥種子的發(fā)芽，增加胚芽鞘和胚根的質(zhì)量，提高發(fā)芽種子在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力，降低胚芽鞘中膜脂過氧化產(chǎn)物的增加量。由此推斷，BCD可以緩解鹽對小麥萌發(fā)階段的傷害，促進小麥種子的萌發(fā)

關(guān)鍵詞：褐煤：褐煤精華液；黃腐酸；小麥；鹽脅迫

中圖分類號：S5 12.1

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）05-0423-08

一般認為，黃腐酸（fulvic acid，F(xiàn)A）是腐植酸類物質(zhì)中相對分子質(zhì)量最小、溶解度最高、生物活性電最強的部分，其含活性官能團多，易被生物體吸收利用。大量研究表明，黃腐酸具有抗鹽、抗旱、調(diào)節(jié)植物生長等諸多植物生理活性。本課題組長期從事黃腐酸化學(xué)組成和生物活性的研究，在通過H202氧化降解褐煤的方法制取黃腐酸過程中得到一種無色透明的蒸餾液，該溶液pH值為2～3，密度為1.02～1.05 g/cm3，其中最大相對分子質(zhì)量小于500（液質(zhì)聯(lián)用測定）。初步活性篩選發(fā)現(xiàn)，該溶液具有比黃腐酸更強的緩解鹽脅迫對小麥種子傷害的活性，同時在無鹽脅迫下也具有明顯的提高種子發(fā)芽率和促進胚芽胚根生長的作用。我們將這種無色透明的溶液命名為褐煤精華液（brown coal distillate.BCD）。

本研究通過測定BCD處理過的兩種小麥煙農(nóng)19和魯原301的發(fā)芽率、胚芽鞘的相對伸長速率和胚芽鞘胚根的長度、鮮重。干重以及胚芽鞘中脯氨酸、可溶性糖、K+、Na+、丙二醛（malondialde-hyde， MDA）含量等指標，系統(tǒng)地考察了BCD塒無鹽及鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響。通過BCD對小麥抗鹽脅迫活性的研究，以期發(fā)現(xiàn)一類新的抗鹽活性物質(zhì)，為小麥抗鹽脅迫研究提供理論基礎(chǔ)，也為植物抗鹽堿高級肥料的開發(fā)及鹽堿耕地的合理、有效利用提供技術(shù)支持。

1

材料與方法

1.1 材料

褐煤采白云南峨山縣小棚租煤礦.干燥后粉碎，過80目篩，進行理化性質(zhì)分析。供試種子為小麥種“煙農(nóng)19”和“魯原301”。改良的Hoagland's培養(yǎng)液：參照文獻[9]配制。

1.2

BCD的制備

將l kg褐煤置于反應(yīng)容器中，加入濃度為15%的H2O2溶液2 L，連續(xù)攪拌3h，溫度控制在35 ℃。待氧化反應(yīng)完成后.將產(chǎn)物離心10 min （轉(zhuǎn)速4 000 r/min），過濾后的上清液即為黃腐酸溶液。將黃腐酸溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在50 ℃下抽真空旋蒸。旋蒸完成后得到的同體物質(zhì)為黃腐酸粗晶。冷凝下來的無色透明的蒸餾液即為褐煤精華液，經(jīng)測定pH值為2.5，密度為1.04 g/cm3。用蒸餾水將BCD分別稀釋為原濃度的（1、5、10、15、20、30、40、50）‰備用。

1.3 BCD的氣質(zhì)聯(lián)用分析條件

儀器型號：Clarus600氣質(zhì)聯(lián)用儀（PerkinElmer，USA）。

氣相色譜條件f超純水洗針進樣）：FFAP色譜柱（Agilent Technologies，USA）；進樣口溫度：240 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度300 ℃，載氣為高純氦；進樣量為0.6μL；柱流量為2 mL/min；程序升溫：柱溫為60 ℃，恒溫3 min，以2 ℃/min升至180℃，恒溫20 min.總用時問83 min；不分流模式進樣。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜接口溫度為260 ℃，離子源溫度200℃：電轟擊電離方式；電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍30～430 amu：溶液延遲時間為5mln：進樣量lμL；傳輸線溫度200℃。

1.4

種子的致敏及萌發(fā)

取籽粒飽滿的種子用自來水漂洗，經(jīng)10%NaCl0消毒10 min后用無菌蒸餾水沖洗7次。蒸餾水和不同濃度的BCD作為致敏液將小麥種子浸泡2h進行致敏，共l8批。取同批致敏一致的種子150粒，整齊擺放到3個直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中（鋪有1層濾紙），每皿50粒，各加入10 mL，Hoagland's培養(yǎng)液。其中，用蒸餾水致敏的空白對照組 （control cheCk 1，CKl）和（1、5、10、15、20）‰BCD組不加NaCI；用蒸餾水致敏的模型對照組（control check 2，CK2）和（10、20、30、40、50）‰ BCD組分別培養(yǎng)在NaCl濃度為125 mmol/L（鹽敏感臨界濃度）的改良Hoagland's培養(yǎng)液中；共24組。用恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，晝夜溫度分別保持在16～26℃和10～16 ℃，平均光周期為14 h。每天用稱重法在培養(yǎng)皿中注水補充蒸發(fā)失去的水分，保證鹽濃度的恒定。

1.5 測定指標

1.5.1 發(fā)芽率及胚芽鞘、胚根長度的測定

種子胚根長度超過種子長度的1/2作為種子發(fā)芽的標準。分別在培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后從各組隨機取12顆發(fā)芽種子測定胚芽鞘長，計算胚芽鞘的相對伸長速率（relative elongationrate，RER）。RER=L2-L1/△t，式中L2為后一次的測量值（mm），L1為前一次的測量值（mm），△t為時問間隔（h）。72 h后同時計算發(fā)芽率.測定胚根長一發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.5.2 胚芽鞘、胚根鮮重和干重的測定

在培養(yǎng)72 h后從各組隨機選取發(fā)芽種子測定胚芽鞘、胚根鮮重和下重。用蒸餾水清洗胚芽鞘和胚根，并用濾紙擦干，用電子天平稱取鮮重后，裝于紙質(zhì)口袋中，置于70 ℃烘箱中至恒重后稱其干重，

1.5.3

胚芽鞘有機小分子物質(zhì)含量的測定

在培養(yǎng)72 h后從各組隨機選取發(fā)芽種子參照文獻的方法測定胚芽鞘中脯氨酸、可溶性糖和丙二醛的含量。

1.5.4 胚芽鞘中離子含量的測定

根據(jù)參考文獻的方法測定胚芽鞘中K+、Na+的含量。

2

結(jié)果與分析

2.1 BCD的GC-MS分析結(jié)果

經(jīng)多次優(yōu)化條件，初步得到BCD的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜（圖1），結(jié)果顯示BCD中至少含有9種物質(zhì)（表2）。大部分化合物對植物種子萌發(fā)的影響及其抗鹽性未見文獻報道，但它們結(jié)構(gòu)中多含有羥基、羧基、羰基等活性基團，植物對這些小分子有機物的吸收和積累可以提高細胞滲透壓，增強植物抗鹽能力。其中，化合物（1）和（8）即乙酸和丙酸可以抑制細菌和真菌生長，這有利于植物良好生長環(huán)境的建立?；衔铮?）尿素可以為植物的生長提供氮源，促進細胞的分裂和生長，提高植物抗逆性。分析表明，這些化合物具有潛在的抗鹽性它們單獨對小麥種子萌發(fā)的影響和抗鹽性，以及相互之間的關(guān)系將是本課題之后的研究重點，

2.2 小麥種子鹽敏感臨界濃度的確定

由圖2可知，相較于CK1處理，低濃度NaClf≤100 mnlol/L）處理小麥種子發(fā)芽率變化較小，而高濃度NaCl（≥150 mmol/L）處理時發(fā)芽率下降迅速，降至20%以下。我們選擇中間濃度125 mmol/L繼續(xù)進行試驗，發(fā)現(xiàn)該濃度下小麥煙農(nóng)19和魯原301第3天的平均發(fā)芽率分別為52.3%和54.5%，該濃度為較佳的鹽處理濃度，稱該濃度為小麥種子的鹽敏感臨界濃度。

2.3 BCD對小麥胚芽鞘RER的影響

由圖3可知，煙農(nóng)19和魯原301的CKI組胚芽鞘RER最大值都出現(xiàn)在第48 h，CK2組RER最大值推后，出現(xiàn)在第60 h，且約為CK1組的2/3，表明鹽脅迫下胚芽鞘的伸長受到明顯抑制，在無鹽脅迫下，兩種小麥的（1、5、10、l5）‰BCD處理組相較于CK1組RER有所增加，且10‰ BCD組的RER最大值出現(xiàn)的時間提前到第36 h。相較于CK1，煙農(nóng)19的20‰ BCD組RER有所降低，魯原301的變化不明顯：在鹽脅迫下兩種小麥的（10、20、30、40）‰ BCD處理組相較于CK2組RER有所增加，且40‰ BCD組的RER最大值出現(xiàn)的時間提前劍第48h。相較于CK2，煙農(nóng)19的50‰ BCD組RER有所降低，魯原301的變化不明顯。魯原301在48 h之前RER高于煙農(nóng)19，而在48 h之后有一半數(shù)值低于煙農(nóng)19，其中有2/3出現(xiàn)在BCD處理組。這說明BCD處理組在48 h之前對魯原301胚芽鞘伸長的作用優(yōu)于對炯農(nóng)19的作用，而在48 h之后對兩者RER的作用逐漸接近。由此可見BCD能促進小麥胚芽鞘的伸長，同時具有緩解鹽對胚芽鞘伸長的抑制作用，但對不同品種小麥作用效果不同.這可能跟小麥的品質(zhì)有關(guān)。

2.4 BCD處理對小麥種子發(fā)芽率、胚芽鞘胚根長度的影響

從表3可以看出，無鹽脅迫下，兩種小麥的l～15‰ BCD處理組發(fā)芽率、胚芽鞘和胚根的長度大多數(shù)高于空白對照組（CKl），其中l(wèi)0‰ BCD處理組效果最明顯，炯農(nóng)19的這3個生理指標分別增加了（4.3、20.7、l7.1）%，魯原301分別增加了（5.6、16.6、13.4）%，煙農(nóng)19胚芽鞘和胚根長度的增幅均高于魯原301。20‰ BCD處理對煙農(nóng)19的這3個生理指標有明顯的抑制作用，其中對發(fā)芽率極顯著抑制（P

2.5 BCD處理對小麥胚芽鞘和胚根鮮重、干重的影響

從圖4可以看出，無鹽脅迫下，兩種小麥的BCD處理組與空白對照組相比胚芽鞘和胚根的鮮重、干重大部分均有所增加，其中l(wèi)O‰ BCD組增加幅度最大，煙農(nóng)19的胚芽鞘鮮重、干重，胚根的鮮重、干重分別增加了（10.74、19.O、8.2、28.0）%，魯原301的這4個指標分別增加了（11.0、19.5、7.2、l 8.2）‰。魯原301胚芽鞘的鮮重、干重增幅大于煙農(nóng)19，胚根的鮮重、于重增幅小于煙農(nóng)19；鹽脅迫下，兩種小麥的BCD處理組同對照組相比胚芽鞘和胚根的鮮重、干重大部分有所增加，其中40‰ BCD組增加幅度最大，煙農(nóng)19的胚芽鞘鮮重、干重，胚根的鮮重、干重分別增加了（13.3、18.6、14.0、37.1）%，魯原301的這4個指標分別增加了（15.9、24.4、10.4、35.1）%。魯原301胚芽鞘的鮮重、干重增幅同樣大于煙農(nóng)19，胚根的鮮重、干重增幅小于煙農(nóng)19。以上結(jié)果表明，在無鹽及鹽脅迫下BCD處理對魯原301胚芽鞘的促進作用均強于對煙農(nóng)19胚芽鞘的作用，對胚根的促進作用弱于對煙農(nóng)19胚根的作用。

2.6 BCD處理對小麥胚芽鞘脯氨酸和可溶性糖含量的影響

從圖5可以看出，兀鹽脅迫下，BCD處理相較于空白對照（CKl）兩種小麥的脯氨酸和可溶性糖含量都逐漸增大，其中l(wèi)O‰ BCD處理效果最好。煙農(nóng)19胚芽鞘的脯氨酸和可溶性糖含量分別增加了37.5%和48.7%，魯原301胚芽鞘的這兩種物質(zhì)的含量分別增加了57.2%和50.4%，增加幅度均大于炯農(nóng)19。20‰ BCD處理組，煙農(nóng)19胚芽鞘的這兩種物質(zhì)沒有增加反而降低.魯原301依然有所增加或增加很少；鹽脅迫下，BCD處理相較于模型對照（CK2）兩種小麥的脯氨酸和可溶性糖含量也都逐漸增大，其中30‰ BCD處理效果最好，煙農(nóng)19胚芽鞘的脯氨酸和可溶性糖含量分別增加了36.5%和27.2%，魯原301胚芽鞘的這兩種物質(zhì)的含量分別增加了19.7%和45.8%，其中可溶性糖含量增幅大于煙農(nóng)19。50‰BCD處理后，煙農(nóng)19胚芽鞘的這兩種物質(zhì)沒有增加反而降低，魯原301依然有所增加或降低很少。從以上結(jié)果看出，相較于煙農(nóng)19，BCD更有利于魯原301胚芽鞘脯氨酸和可溶性糖含量的增加。同時可以看到較高濃度BCD組魯原301胚芽鞘脯氨酸和可溶性糖含量依然有少量增加或降低很少。

2.7 BCD處理對小麥胚芽革肖中K+、Na+和MDA含量的影響

由表4可以看出，無鹽脅迫下，兩種小麥的BCD處理組相較于空白對照組K+含量逐漸升高，Na+和MDA含量逐漸降低。其中l(wèi)oo/oo BCD處理組變化最明顯，煙農(nóng)19和魯原301的K+含量分別增加23.7%和42.1%，Na+含量分別減少了86.4%和91.6%， MDA含量分別降低了38.2%和58.6%，魯原301的變化量均大于煙農(nóng)19。20‰BCD處理對炯農(nóng)19離子調(diào)節(jié)沒有抑制并且使MDA含量有所降低；相較于無鹽脅迫（CKl），鹽脅迫下（CK2）兩種小麥胚芽鞘的K+含量都明顯降低，Na+和MDA含量都明顯升高。兩種小麥的BCD處理組相較于模型對照組K+含量逐漸升高，Na+和MDA含量逐漸降低。其中30%。BCD處理組變化最明顯.煙農(nóng)19和魯原301的K+含量分別增加了9.9%和10.0%，Na+含量分別減少了28.0%和49.9%，MDA含量分別降低了52.2%和60.3 %，魯原301的變化量同樣均大于煙農(nóng)19。煙農(nóng)19的50‰ BCD處理組相較于CK2組，K+、Na+和MDA含量都降低，魯原301K+含量增大，Na+和MDA降低?？梢姡邴}脅迫下，50‰ BCD依然有利于魯原301進行離子調(diào)節(jié)和降低胚芽鞘中過氧化產(chǎn)物，而對煙農(nóng)19的離子調(diào)節(jié)作用不明顯，但有降低過氧化產(chǎn)物的作用。

3 討論

很多禾谷類植物實驗研究證明，種子萌發(fā)的好壞對最終的作物產(chǎn)量有很重要的影響。萌發(fā)期是禾谷類作物整個生長過程中耐鹽性最薄弱的階段之一，因此提高禾谷類作物萌發(fā)期的耐鹽性具有重要意義。本實驗中BCD處理減緩了鹽脅迫對胚芽鞘伸長的抑制作用，將對該小麥品種整個生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響。

鹽脅迫下植物種子的萌發(fā)受土壤滲透脅迫的影響顯著，土壤中鹽分過多，使土壤水勢降低，植物吸水困難，從而造成細胞缺水，萌發(fā)受到抑制而植物中碳水化合物的積聚有利于滲透調(diào)節(jié)植物通過主動增加細胞內(nèi)溶物質(zhì)降低細胞滲透勢（如CK2處理），因而能從環(huán)境中繼續(xù)吸收水分，這個過程就是滲透調(diào)節(jié)作用。本實驗中，125 mmol/LNaCI處理相較于空門對照組，兩種小麥胚芽鞘中Na+、脯氨酸、可溶性糖含量都明顯升高，K+含量明顯降低，這是小麥受到鹽脅迫的表現(xiàn)。經(jīng)BCD處理后Na+含量逐漸降低，脯氨酸、可溶性糖和K+含量逐漸升高，這有利于小麥發(fā)芽種子進行滲透調(diào)節(jié)，降低鹽脅迫傷害作用。這與小麥發(fā)芽率、胚芽鞘RER、胚芽鞘和胚根的長度、鮮重、干重有明顯的正相關(guān)性，與 MDA含量呈負相關(guān)性。30‰BCD對鹽脅迫下兩種小麥緩解鹽脅迫的作用最好，但對不同的小麥品種促進作用不同，整體來看，BCD對魯原301促進滲透調(diào)節(jié)和抗氧化的作用優(yōu)于對煙農(nóng)19的作用。50‰ BCD濃度較高，對煙農(nóng)19的滲透調(diào)節(jié)大體有抑制作用，其原因可能是低濃度的BCD能激發(fā)該小麥品種的抗鹽機制，而高濃度的BCD本身作為脅迫因子阻礙了種子的萌發(fā)；對魯原301的滲透調(diào)節(jié)有少量的促進作用，可能是魯原301抗環(huán)境脅迫能力比煙農(nóng)19好。

BCD同樣能促進無鹽脅迫下兩種小麥的萌發(fā)，最佳濃度為‰，比鹽脅迫下最佳BCD濃度低很多。該濃度對魯原301萌發(fā)的促進作用大體優(yōu)于對煙農(nóng)19的作用。20‰ BCD對炯農(nóng)19種子萌發(fā)有部分抑制作用，對魯原301大體有促進作用。

有研究表明FA克服了Fe從土壤溶液到植物根部擴散的限速步驟，F(xiàn)e-FA作為肥料的效能遠高于FeCl3，對于解決作物中的Fe缺乏有重要的意義，這與FA中化合物分子結(jié)構(gòu)的羧基、酚羥基、醇羥基和醌基等基團與金屬離子的絡(luò)合作用有關(guān)。BCD可看做是FA混合物中易揮發(fā)的部分.其化合物相對分子質(zhì)量更小，含有更多羧基、羥基等活性基團，在植物體中的擴散及離子調(diào)節(jié)更有優(yōu)勢，并且小研究預(yù)實驗結(jié)果證實BCD促進植物種子萌發(fā)的作用優(yōu)于FA，因此BCD對Fe及其他離子的轉(zhuǎn)運作用值得進一步研究。植物體一般含有較高水平的抗氧化劑，不管是本身具有的還是外源物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，都會有增強植物抵抗環(huán)境脅迫能力的作用。在本實驗中，BCD處理降低了鹽脅迫下小麥胚芽中MDA的含量，緩解了鹽脅迫對細胞的氧化損傷，這與欒白、郭偉等報導(dǎo)的結(jié)果一致，因此在本實驗中作為FA較優(yōu)級分的BCD很有可能充當了小麥抗氧化劑誘導(dǎo)劑。

在本實驗中，BCD在極低濃度下表現(xiàn)出促進種子萌發(fā)和緩解鹽脅迫對小麥生長抑制的作用，表明BCD是一種含小分子有機混合物的具有高效抗鹽活性的溶液，適合開發(fā)為抗鹽脅迫及調(diào)節(jié)植物生長的高級肥料或添加劑。本課題不僅能為小麥抗鹽脅迫研究提供理論基礎(chǔ)，還可以為合理有效地利用鹽堿耕地提供有力的技術(shù)支持。