王新　劉麗　吳賀軍等

摘要 [目的]篩選對(duì)克百威和毒死蜱的優(yōu)勢降解菌。[方法]選取克百威和毒死蜱2種農(nóng)藥作為降解對(duì)象，通過分別對(duì)特定水樣中微生物進(jìn)行馴化、分離、純化等處理后，各獲得多株細(xì)菌和真菌；以2種農(nóng)藥分別作為唯一碳源，測定各菌株5 d內(nèi)的化學(xué)需氧量（COD）值，通過COD去除率篩選出克百威和毒死蜱的優(yōu)勢降解菌。[結(jié)果]在可降解克百威的細(xì)菌LLBK1～10組中LLBK2、LLBK6和LLBK7的COD去除率較高，分別為93.83%、93.21%和93.83%，3株菌種均為革蘭氏陰性菌；在可降解克百威的真菌LLFK1～3組中LLFK1和LLFK2的COD去除率較高，分別為77.16%和79.01%；同時(shí)可降解毒死蜱的細(xì)菌LLBD1～8組中LLBD1、 LLBD3和LLBD4的COD去除率較高，分別為57.69%、59.23%和56.92%，3株菌種同樣均為革蘭氏陰性菌；在可降解毒死蜱的真菌LLFD1～3組中LLFD1、LLFD3的COD去除率較高，分別為61.54%和59.23%。[結(jié)論]為克百威和毒死蜱的降解研究提供了參考。

關(guān)鍵詞 克百威；毒死蜱；馴化；篩選；COD去除率

中圖分類號(hào) S482；X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06699-04

Acclimation and Screening of Degradable Microorganisms of Carbofuran and Chlorpyrifos

WANG Xin et al

（Shen Yang University of Technology， Shenyang， Liaoning 110870）

Abstract [Objective] The aim was to screen degradable microorganisms of Carbofuran and Chlorpyrifos. [Method] Carbofuran and Chlorpyrifos were chosen as degrading objects. By acclimation of microorganisms in the water， the bacteria that could degrade Carbofuran and Chlorpyrifos were obtained. After plate separation and purification， screening bacteria could be obtained. Several fungi and bacteria with higher degradation ability were obtained in the experiment， compared with their degrading capability， via COD removal efficiency under the condition of the pesticides as the sole carbon source in five days. [Result] In the group of LLBK110， the COD removal rates of gramnegative bacteria LLBK2， LLBK6 and LLBK7 were higher， up to 93.83%， 93.21% and 93.83%， respectively； in the group of LLFK13， the COD removal rate of LLFK1 and LLFK2 were higher， up to 77.16% and 79.01%， respectively； in the group of LLBD18， the COD removal rates of gramnegative bacteria LLBD1， LLBD3 and LLBD4 were higher， up to 57.69%， 59.23% and 56.92%， respectively； in the group of LLFD13， the COD removal rates of LLFD1 and LLFD3 were higher， up to 61.54% and 59.23%， respectively. [Conclusion] The results provide reference for study on degradation of Carbofuran and Chlorpyrifos.

Key words Carbofuran； Chlorpyrifos； Acclimation； Screening； COD removal rate

克百威與毒死蜱是農(nóng)田中較常使用的2種農(nóng)藥?？税偻–arbofuran），別名呋喃丹，化學(xué)名稱為2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃-甲基氨基甲酸酯，屬氨基甲酸酯類農(nóng)藥[1]，1967年由美國FMC公司首次合成，1968年注冊(cè)使用[2]。克百威作為一種高效廣譜的殺蟲劑極難降解，在旱地土壤中的半衰期一般為30～60 d，其長時(shí)間的殘留對(duì)土壤及地下水都會(huì)造成不同程度的污染[3]。近年來國內(nèi)外關(guān)于克百威降解的研究報(bào)道逐年增多[4-8]。

毒死蜱（Chlorpyrifos），化學(xué)名稱為O，O二乙基O（3，5，6三氯2吡啶基）硫代磷酸酯，是由美國陶氏益農(nóng)公司于1964年研制出的一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷殺蟲、殺螨劑。毒死蜱作為代替高毒有機(jī)磷類農(nóng)藥的主要有機(jī)農(nóng)藥品種，在我國的應(yīng)用日益廣泛，危害也在逐步擴(kuò)大[9]。其在土壤中的半衰期受本身濃度、土壤酸堿度、微生物活動(dòng)狀況等各種因素影響，在不同條件下半衰期從幾天到幾百天不等。現(xiàn)今已有很多研究人員將目光轉(zhuǎn)移到毒死蜱農(nóng)藥的降解問題上[10-14]。

為此，筆者采用微生物法，以克百威和毒死蜱為降解對(duì)象，選取原沈陽東北制藥廠廠區(qū)內(nèi)土壤為試驗(yàn)土樣，經(jīng)過馴化、篩選等步驟篩選出分別對(duì)2種農(nóng)藥有一定降解作用的菌種，并通過各菌株的COD去除率確定了降解效果較好的幾株菌株，以期為克百威和毒死蜱的降解研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥劑。克百威：江蘇鎮(zhèn)江建蘇農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn)；毒死蜱：山東榮邦化工有限公司生產(chǎn)；細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉；真菌培養(yǎng)基：鮮土豆、葡萄糖；COD試劑：意大利哈納。

1.1.2 儀器。

LXLC50型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，安徽合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；HZQA型數(shù)顯恒溫?fù)u床，江蘇蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；BPX52數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；微電腦化學(xué)需氧量測定儀，意大利哈納。

1.2 方法

1.2.1 菌種的馴化。

將取自原沈陽東北制藥廠廠區(qū)內(nèi)的土樣（分為濕土和干土）加入蒸餾水振蕩2 h后，各取2份150 ml的上清液于錐形瓶中，標(biāo)為干樣1、干樣2和濕樣1、濕樣2。向2種樣1中加入毒死蜱，其濃度為16 mg/L，向2種樣2中加入克百威，其濃度為20 mg/L。將4個(gè)錐形瓶放入同一恒溫?fù)u床中振蕩，溫度為35 ℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min，培養(yǎng)周期為48 h。

水樣中進(jìn)行的菌種馴化需要連續(xù)幾個(gè)周期，每次轉(zhuǎn)接時(shí)取上一周期水樣15 ml加入另一錐形瓶中，向其中分別加入2種農(nóng)藥適量，再加入蒸餾水至150 ml，然后放入恒溫?fù)u床振蕩。在轉(zhuǎn)接過程中應(yīng)適當(dāng)增加2種農(nóng)藥的濃度（表1）。

1.2.2 菌種的分離。

采用平板劃線法。向溶解的固體細(xì)菌培養(yǎng)基和固體真菌培養(yǎng)基中分別加入克百威和毒死蜱，其濃度分別為20、16 mg/L，并做好標(biāo)記，于高壓滅菌器中滅菌30 min。

滅菌后迅速將各儀器和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌室內(nèi)，將已融化并冷卻至50 ℃左右的固體培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿蓋上做好標(biāo)記。待培養(yǎng)基凝固后，用接種環(huán)分別挑取1環(huán)馴化好的水樣，在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上劃線，每個(gè)樣品平行5個(gè)。待全部劃線完成后，將所有培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后部分長勢較好的單個(gè)菌落見圖1。

圖1 培養(yǎng)基上長勢較好的單個(gè)菌落

1.2.3 菌種的純化。

采用平板劃線法。將在培養(yǎng)基上長勢較好的可分別降解克百威、毒死蜱的細(xì)菌菌落和真菌菌落轉(zhuǎn)接至對(duì)應(yīng)的、農(nóng)藥濃度提高了10%的新培養(yǎng)基上，之后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。上述農(nóng)藥濃度提升的轉(zhuǎn)接進(jìn)行3次。

完成菌種純化后，在其中選取長勢良好的菌落轉(zhuǎn)接至對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基保存。最后確定10株可降解克百威的細(xì)菌（標(biāo)記為LLBK1～10）、3株可降解克百威的真菌（標(biāo)記為LLFK1～3）、8株可降解毒死蜱的細(xì)菌（標(biāo)記為LLBD1～8）和3株可降解毒死蜱的真菌（標(biāo)記為LLFD1～3）。

1.2.4 菌株的篩選。

為得到對(duì)克百威和毒死蜱具有較高降解效率的菌株，菌株純化后需對(duì)其進(jìn)行篩選。采用測定COD的方法，即通過比較各菌株的COD去除率來確定菌株降解農(nóng)藥的能力，從而篩選出優(yōu)勢菌株。

1.2.5 分析方法。

在2種農(nóng)藥作為唯一碳源的條件下對(duì)各菌株進(jìn)行5 d的COD值測定，通過與對(duì)照組COD數(shù)據(jù)值的比較來判斷各菌株是否起到降解農(nóng)藥的作用，通過比較各菌株最終的COD去除率篩選出降解2種農(nóng)藥效果最好的優(yōu)勢菌。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0軟件，運(yùn)用Duncan′s新夏極差法檢驗(yàn)各菌株COD去除率差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 可降解克百威的細(xì)菌的COD測定結(jié)果

由圖2可知，唯一碳源條件下可降解克百威的10株細(xì)菌在5 d的COD測定過程中表現(xiàn)出不同的下降趨勢。首先，10株細(xì)菌在第1天內(nèi)的COD下降趨勢最明顯，隨后幾天COD下降值變化則較平緩。從對(duì)照組的5 d COD測定數(shù)據(jù)可以看出，即使不加入菌株其COD值也會(huì)由于其他原因而減小，但加入菌株的克百威水樣中COD值明顯小于對(duì)照組，說明加入的各菌株起到降解克百威的作用。

2.2 可降解克百威的真菌的COD測定結(jié)果

在唯一碳源的條件下可降解克百威的3株真菌在5 d的COD測定過程表現(xiàn)出COD下降趨勢（圖4）。3株真菌在第1天的COD下降趨勢最明顯，且在每一次的數(shù)據(jù)測定中加入了菌株的克百威水樣的COD值均明顯小于對(duì)照組，說明加入的真菌菌株起到降解克百威的作用。

2.3 可降解毒死蜱的細(xì)菌的COD測定結(jié)果

由圖6可知，8株細(xì)菌在5 d的COD測定過程中同樣表現(xiàn)出不同的COD下降趨勢。各株細(xì)菌在第1天的COD下降趨勢都不是最明顯，并且整個(gè)測定期間內(nèi)總體的COD變化都較平緩。將對(duì)照組的5 d COD測定數(shù)據(jù)同加入了菌株的水樣的COD測定值相比，各階段的對(duì)照組數(shù)據(jù)都要大于加入了菌株的水樣組數(shù)據(jù)，表明加入的菌株起到降解毒死蜱的作用。

2.4 可降解毒死蜱的真菌的COD測定結(jié)果

由圖8可知，在5 d的測定期間3株真菌的COD下降趨勢各不相同，各菌株的COD降低量在5 d內(nèi)差值并不大。將加入菌株的水樣的COD測定值同對(duì)照組的COD測定數(shù)據(jù)相比后可以看出，加入的各菌株起到降解農(nóng)藥毒死蜱的作用。

3 結(jié)論

通過馴化和篩選得到對(duì)克百威和毒死蜱具有一定降解作用的多株菌株。在克百威作為唯一碳源的條件下，經(jīng)過對(duì)各菌株COD去除率的比較，在可降解克百威的細(xì)菌組中篩選出3株菌種的COD去除率較高，即為對(duì)克百威的降解效率較高，它們分別為LLBK2、LLBK6和LLBK7號(hào)菌株，其COD去除率分別為93.83%、93.21%和93.83%；在可降解克百威的真菌組中篩選出2株菌種的COD去除率較高，分別為LLFK1和LLFK2號(hào)菌株，COD去除率分別為77.16%和79.01%。在毒死蜱作為唯一碳源的條件下，從可降解毒死蜱的細(xì)菌組中篩選出3株菌種的COD去除率較高，它們分別為LLBD1、LLBD3和LLBD4號(hào)菌株，其COD去除率分別為57.69%、59.23%和56.92%。在可降解毒死蜱的真菌組中篩選出2株菌種的COD去除率較高，分別為LLFD1、LLFD3號(hào)菌株，其COD去除率分別為61.54%和59.23%。

各株細(xì)菌經(jīng)過革蘭氏染色后，確定均為革蘭氏陰性菌，同時(shí)可降解毒死蜱的3株細(xì)菌亦均為球菌。

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