汪思遠(yuǎn)等

摘 要：細(xì)胞色素P450（CYP450）是動(dòng)植物及微生物體內(nèi)一類(lèi)超基因家族編碼的單加氧酶，參與多種催化反應(yīng)，在生物防御方面具有重要作用。近年來(lái)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)和新一代測(cè)序手段及生物信息學(xué)分析方法，對(duì)參與相關(guān)生物代謝合成途徑中的CYP450進(jìn)行了分離、篩選及功能鑒定，進(jìn)一步闡明了CYP450在植物體內(nèi)相關(guān)代謝途徑中的催化機(jī)制。本文對(duì)植物細(xì)胞色素P450（CYP450）基因的分離，在皂苷生物合成、苯丙烷類(lèi)物質(zhì)代謝和芥子油苷及IAA生物合成中的功能和表達(dá)，以及在人工合成物質(zhì)的解毒功能及應(yīng)用等方面的研究做了簡(jiǎn)要綜述。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞色素P450 植物次生代謝 表達(dá)調(diào)控

Research Process of Cytochrome P450 in Plant

WANG Si-yuan，JIANG Shi-cui，WANG Kang-yu，WANG Yi，ZHANG Mei-ping

（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：Cytochrome P450s are a diverse array of mixed-function oxidas in animal，plant and bacteria which consist of a gene superfamily.They play an important role in preventing the plants from injury by catalyzing many kinds of reactions.Several candidate CYP450s that might be involved in ginsenoside biosynthesis have been discovered，screening and functional identification by the modern biotechnology and next generation sequencing technology and bioinformatic analysis in previous studies，further elucidate in the relevant CYP450 catalytic mechanism of metanolic pathways in plants.This article summarized gene isolation，function and expression of ginsenoside biosynthesis pathway briefly，phenylpropanoid metabolic pathway and glucosinolates and IAA biosynthesis pathway，and research in the detoxification function and application of synthetic substances.

Key words：Cytochrome P450，Plant secondary metabolism，Expression regulation、

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，簡(jiǎn)稱(chēng)P450）是一類(lèi)以血紅素為輔基的B族細(xì)胞色素超家族蛋白酶，是血紅素蛋白大家族中極其重要的一員，通常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體、高爾基體等細(xì)胞器膜結(jié)合，分布在生命進(jìn)化過(guò)程中的所有分支。之所以命名為P450是因?yàn)檫€原態(tài)P450與一氧化碳結(jié)合后在450nm處有一吸收峰。因其能插入一個(gè)氧原子到疏水性分子而使它們變得更具有活性或者親水性，所以又被稱(chēng)為單加氧酶（mixed-function oxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)MFO）[1]。最早于1958年在大鼠肝微粒體中被發(fā)現(xiàn)。1969年，D.S Frear首次在植物（棉花）中發(fā)現(xiàn)了它的存在。至此之后，大量的研究報(bào)道表明在包括小麥[2]、蓖麻[3]等許多植物中也均有P450的出現(xiàn)。細(xì)胞色素P450作為植物中最大的家族蛋白在植物體內(nèi)起著重要作用。

隨著細(xì)胞色素P450的蛋白組成及結(jié)構(gòu)等生化特性日趨明朗，研究學(xué)者們逐步將研究方向轉(zhuǎn)移到它所參與的生物體內(nèi)相關(guān)代謝途徑和催化反應(yīng)等方面。那么，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，越來(lái)越多的CYP450被成功的克隆分離及外源表達(dá)，這大大加快了闡明植物次生代謝途徑機(jī)制及關(guān)鍵酶基因功能的研究進(jìn)展。本文就目前CYP450研究的現(xiàn)狀，著重對(duì)近年來(lái)CYP450的分離及其在所參與的生物合成代謝途徑中的功能和表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 植物細(xì)胞色素P450的分類(lèi)

P450基因是一個(gè)古老的超基因家族，通常根據(jù)基因編碼氨基酸序列的相似性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系對(duì)P450進(jìn)行分類(lèi)和命名。在試圖確定新發(fā)現(xiàn)的P450基因與已知P450基因是否為同一家族時(shí)，主要看二者氨基酸序列比對(duì)時(shí)一致性的比例，若大于40%則它們屬于同一個(gè)家族，否則屬于一個(gè)新的家族；若大于40%但小于55%，則它們屬于同一家族的兩個(gè)不同的亞家族；若大于55%，則它們屬于同一亞家族。其等位基因氨基酸序列的同源性不小于97%[4]。植物的第一個(gè)P450cDNA是CYP71A1，這是1990年由Bozak，K.R.，Yu.H.[5]等在鱷梨中分離的和成熟相關(guān)的基因。陸生植物細(xì)胞色素P450可分為11個(gè)簇（clans），歸為2類(lèi)：?jiǎn)渭易宕兀–YP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746）和多家族簇（CYP71、CYP72、CYP85、CYP86）[6]。研究表明，所有生物細(xì)胞色素P450分子之間都具有一定的序列保守性，即細(xì)胞色素P450具有不同物種間的同源性，這種同源性表明它們都起源于同一個(gè)共同的祖先。那么根據(jù)所有已知結(jié)構(gòu)的細(xì)胞色素P450基因的特點(diǎn)，將結(jié)構(gòu)中存在保守FxxGxRxCxG序列的血紅素結(jié)合域（Heme-binding region），作為鑒定P450的主要特征。

2 植物細(xì)胞色素P450基因的分離

隨著人們對(duì)植物基因組研究深度和廣度的提高，近年來(lái)，研究人員從擬南芥、番茄、水稻、玉米、大豆等主要農(nóng)作物中分離得到的細(xì)胞色素P450基因也日益增多。植物中細(xì)胞色素P450基因的數(shù)目約占整個(gè)基因組基因數(shù)目的1%。Nelson[7]等比較分析結(jié)果表明：大多數(shù)已知的細(xì)胞色素P450基因家族，在約2億年前單子葉植物與雙子葉植物分化之前就已經(jīng)存在了。截至2009年8月，已發(fā)布了共11 294條單一細(xì)胞色素P450基因（見(jiàn)表1）。綜合http：//drnelson.ut mem.edu/Cytoc hrome P450.html所發(fā)表的數(shù)據(jù)。

自發(fā)現(xiàn)P450以來(lái)，隨著研究的深入人們逐步將視線鎖定在它的分離及其功能鑒定上，因P450蛋白是原核生物可溶性蛋白中的一種，其化學(xué)性質(zhì)易于分離純化；而在真核生物中，它往往是通過(guò)N-端的疏水序列或者疏水環(huán)與線粒體內(nèi)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，因此很難分離純化，故人們一直將真核生物P450蛋白的分離作為研究的重點(diǎn)。1991年Durst[8]等發(fā)現(xiàn)植物P450蛋白具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：含量低、不穩(wěn)定、細(xì)胞壁不易破碎、水解酶活性及干擾物質(zhì)含量高，這些特點(diǎn)導(dǎo)致植物P450蛋白的分離異常困難。到目前為止，利用差異篩選法、抗體或探針篩選cDNA文庫(kù)，序列同源性等方法已成功地分離了數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)胞色素P450基因（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/），部分P450基因功能已得到鑒定[9]。

3 植物P450基因參與的生化途徑

植物細(xì)胞色素P450具有廣泛的催化活性，在植物體內(nèi)催化多種初級(jí)和次級(jí)代謝反應(yīng)，主要用于涉及萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、甾醇類(lèi)、脂肪酸、植物激素、信號(hào)分子、色素、黃酮類(lèi)、異黃酮等的合成和代謝反應(yīng)；以及為了使植物抵抗病蟲(chóng)害和一些非生物脅迫，對(duì)部分人工合成的除草劑、殺蟲(chóng)劑等進(jìn)行修飾，對(duì)毒化物質(zhì)進(jìn)行降解，從而使植物免受毒害時(shí)參與的物質(zhì)代謝[10，11]。催化作用的共同點(diǎn)是在底物分子中加入一個(gè)氧原子。P450蛋白質(zhì)種類(lèi)的多樣性和底物催化的重疊性，導(dǎo)致催化反應(yīng)機(jī)制廣泛而復(fù)雜，如在烯基的環(huán)氧化反應(yīng)、烷基的烴化作用、脫烷基作用等10多種作用中有突出體現(xiàn)。正因?yàn)镃YP450具有多種功能而被人們稱(chēng)為“萬(wàn)能的生物催化劑”。

由于CYP450多樣而復(fù)雜，賦予不同的P450同工酶具有不同的催化機(jī)制、底物特性和反應(yīng)活性，因此生物對(duì)多種物質(zhì)具有代謝能力。植物細(xì)胞色素P450主要參與生物合成和生物解毒兩大類(lèi)功能代謝[12，13]。

3.1 植物細(xì)胞色素P450參與的生物合成途徑

3.1.1 參與皂苷生物合成的CYP450

三萜皂苷類(lèi)化合物廣泛存在于自然界中，在其生物合成的過(guò)程中，植物細(xì)胞色素P450主要催化三萜骨架惰性甲基和亞甲基的氧化[14，15]。然而，由于其催化反應(yīng)的復(fù)雜性，因此關(guān)于催化機(jī)制的研究較少。近年來(lái)，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，植物基因組及轉(zhuǎn)錄組水平的測(cè)序分析工作也取得了階段性進(jìn)展，篩選出了與皂苷生物合成相關(guān)的細(xì)胞色素P450，并驗(yàn)證了候選基因的生物學(xué)功能， 使皂苷生物合成途徑得到了進(jìn)一步闡明。

2006年Shibuya等[16]從大豆Glycinemax（L.）Merr.中鑒定了第一個(gè)參與皂苷元修飾的細(xì)胞色素P450酶CYP93E1。

燕麥根皂苷也是一類(lèi)三萜化合物，分離克隆燕麥根皂苷突變體對(duì)闡明燕麥皂苷合成的通路十分必要，Qi等[17]對(duì)燕麥根皂苷缺陷突變體Sad2進(jìn)行了研究，并證明它是一種可催化β-香樹(shù)脂醇轉(zhuǎn)換為燕麥根皂苷的細(xì)胞色素P450酶CYP51H10，可轉(zhuǎn)換為燕麥根皂苷。其表達(dá)僅限于根尖表皮。

目前已證實(shí)參與甘草中三萜皂苷生物合成的細(xì)胞色素P450有CYP88D6、CYP93E3和CYP72A154。與大豆中的CYP93E1一樣，CYP93E3催化β-香樹(shù)脂醇的24位羥基化，而CYP88D6具有β-香樹(shù)脂醇-11-氧化酶活性，實(shí)驗(yàn)表明該酶催化β-香樹(shù)脂醇經(jīng)兩步氧化反應(yīng)，先生成11α-羥基-β-香樹(shù)脂醇，再生成11-羰基-β-香樹(shù)脂醇[18]。11-羰基-β-香樹(shù)脂醇是由β-香樹(shù)脂醇到甘草酸的中間體。而從11-羰基-β-香樹(shù)脂醇到甘草酸的過(guò)程，目前已證明是由CYP72A154催化的3步氧化反應(yīng)完成的，但目前尚不能完全排除在第2步和第3步氧化中其他酶的參與。在酵母中異源表達(dá)結(jié)果顯示CYP72A154催化11-羰基-β-香樹(shù)脂醇的C-30位氧化，同時(shí)，CYP72A154可能在形成不同結(jié)構(gòu)甘草三萜皂苷元的過(guò)程中起到重要作用[19]。組織表達(dá)特異性分析顯示，CYP88D6在根和匍匐枝中表達(dá)，而在葉片和莖中檢測(cè)不到[18]；CYP72A154除葉片外在根、莖和匍匐枝中均有表達(dá)[25]。

Carell等[20]在蒺藜苜蓿中用激活標(biāo)簽法和定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)，鑒定了參與溶血皂苷生物合成的CYP716A12，YP716A12 缺陷突變體可以生成大豆皂苷，但卻不能產(chǎn)生溶血皂苷。在酵母中異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明，催化β-香樹(shù)脂醇C-28位氧化生成齊墩果酸。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，CYP716A12在蒺藜苜蓿不同組織（葉、莖、根）和不同生長(zhǎng)階段（花前期、花期、果期）的表達(dá)量為：在花期最高，在果期最低；不同生長(zhǎng)期基因在根中的表達(dá)水平均較高，且表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定；在葉片中，基因表達(dá)量在生長(zhǎng)期明顯增加，在花期達(dá)到最高值。

此外，Naoumkina等[21]通過(guò)對(duì)蒺藜苜?；蚬脖磉_(dá)聚類(lèi)分析，結(jié)果表明CYP93E2參與皂苷的生物合成。鑒于其與同為豆科植物中的β-香樹(shù)脂醇-24-羥化酶CYP93E1和CYP93E3 的高度同源性，認(rèn)為CYP93E2也具有β-香樹(shù)脂醇-24-羥化酶活性，但具體反應(yīng)尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在植物體內(nèi)，CYP450在不同組織中的表達(dá)具有特異性，如在皂苷合成較多的根和花中的表達(dá)量明顯高于其它組織。在三萜皂苷合成代謝途徑中，像SS、FPS和DS等基因會(huì)響應(yīng)MeJA 誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)，從而使下游細(xì)胞色素P450的表達(dá)量也隨之增加[22]。結(jié)合上述兩種細(xì)胞色素P450的表達(dá)特性不難看出，將植物特定組織進(jìn)行茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，篩選與上游基因SS及DS 相似表達(dá)模式的CYP450，是從CYP450s家族中篩選參與人參皂苷生物合成的CYP450s的重要手段。

Sun[22]等對(duì)西洋參根進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，用轉(zhuǎn)錄組水平最高的CYP450s進(jìn)行茉莉酸甲酯誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。在根、莖、葉和花4個(gè)組織中，僅有屬于CYP716家族的contig0024轉(zhuǎn)錄本與DS表達(dá)模式一致，在系統(tǒng)進(jìn)化上與擬南芥CYP88家族較近。文章把contig00248轉(zhuǎn)錄本作為氧化達(dá)瑪烷或原人參二醇的關(guān)鍵候選CYP450。

Jung等[23]和Wu等[24]分別選取人參、西洋參不同組織部位實(shí)驗(yàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析后得出結(jié)論，人參皂苷表達(dá)有明顯的組織特異性，根中的皂苷含量明顯高于其它組織部位。Choi等人[25]采用茉莉酸甲酯處理植物材料，并對(duì)因外界刺激而使植物體內(nèi)人參皂苷合成途徑中關(guān)鍵酶表達(dá)量升高的CY P450加以探索研究。2011年Han等[26]對(duì)人參不定根進(jìn)行茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，得到分屬11個(gè)家族的53個(gè)CYP450s，其中CYP716A47可誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)，將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，表達(dá)的重組蛋白能催化達(dá)瑪烯二醇-Ⅱ的C-12位羥基化而使其轉(zhuǎn)化為原人參二醇。該報(bào)道首次對(duì)參與人參皂苷合成的CYP450進(jìn)行了功能確證。

Luo等[38]對(duì)三七根進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，得到174個(gè)CYP450s，從中選出轉(zhuǎn)錄組水平較高且可擴(kuò)增得到全長(zhǎng)的15個(gè)CYP450s進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，其中Pn00158 轉(zhuǎn)錄本的相關(guān)特性與西洋參候選CYP450 contig00248轉(zhuǎn)錄本極為相似；有7個(gè)CYP450s屬于CYP71家族，從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系角度分析Pn02132轉(zhuǎn)錄本與CYP93E1很近。文章認(rèn)為Pn00158及Pn02132兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本很可能是參與人參皂苷合成的候選CYP450。

2012年Han等[28]從茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的人參不定根EST文庫(kù)中克隆到CYP716A53v，將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母后表達(dá)的重組蛋白能催化原人參二醇的C-6位羥基化而使其轉(zhuǎn)化為原人參三醇。Balusamy等[29]對(duì)現(xiàn)有人參EST數(shù)據(jù)庫(kù)中全部EST序列進(jìn)行去除冗余、拼接和注釋?zhuān)瑢⒌玫降?16個(gè)預(yù)測(cè)CYP450s進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的這些CYP450s分屬于22個(gè)家族，4個(gè)clans；同時(shí)結(jié)合組織特異性表達(dá)模式與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)不同材料中候選CYP450的表達(dá)量，為參與人參皂苷合成途徑中的候選CYP450s提供了較全面的功能預(yù)測(cè)信息。以上關(guān)于皂苷合成相關(guān)CYP450基因的探索研究，大大促進(jìn)了皂苷生物合成途徑的研究進(jìn)展，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)皂苷的體外合成提供了重要理論基礎(chǔ)。

迄今為止，已命名了5 100個(gè)植物細(xì)胞色素P450酶（http：//drnelson.uthsc.edu/Cytochrome P450.html）。但關(guān)于植物中CYP450基因家族的分類(lèi)和功能鑒定，仍受到許多因素的限制，包括基因組信息尚不明確，用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的材料，在選取和質(zhì)量要求上沒(méi)有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，皂苷下游合成途徑并不完全明晰，很難獲得相應(yīng)的底物和產(chǎn)物等，都將制約CYP450基因的發(fā)掘速度。

3.1.2 參與苯丙烷類(lèi)生物合成的P450基因

苯丙烷途徑（圖2）是植物特有次生代謝途徑，衍生于莽草酸途徑，也是植物三大次生代謝途徑之一，代謝產(chǎn)物均具有1個(gè)由苯丙氨酸合成的C6-C3骨架結(jié)構(gòu)。目前，發(fā)現(xiàn)了多種經(jīng)常出現(xiàn)在苯丙烷類(lèi)代謝分支途徑中關(guān)鍵步驟里的P450，包括C4H、F3H、F35H、IFS、F2H、FNSⅡ等。催化苯丙烷途徑的第2步反應(yīng)的肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamate4-hydroxylase，CHC），它是第一個(gè)被鑒定的植物CYP450單加氧酶[30]，也是第一個(gè)被克隆并確定功能的植物CYP450，迄今綠豆、菊芋等的CHC基因已被分離[31，32]。CHC對(duì)肉桂酸的催化作用具有專(zhuān)一性，相對(duì)于其他細(xì)胞色素P450最明顯的特點(diǎn)是，在植株的各個(gè)組織中均具有很高的活性。在某些植物中，它會(huì)因?yàn)榻M織的損傷或光照等原因而影響誘導(dǎo)活性；同時(shí)，因其處于催化反應(yīng)的中心位置，且它參與的代謝途徑均產(chǎn)生大量的重要代謝物質(zhì)，如一些植物可通過(guò)苯丙烷類(lèi)代謝產(chǎn)生如木質(zhì)素、丹寧等重要代謝物，因此得到了廣泛的研究。駱萍[33]在研究CYP450參與的棉酚合成過(guò)程中，分離得到2個(gè)CHC同源cDNA克隆CYP73A25和CYP73A26。經(jīng)過(guò)RT-PCR分析得出，種子中CYP73A25的表達(dá)水平很低，而在花瓣、花萼和果皮表達(dá)水平則很高；棉花的花瓣、花萼、果皮及發(fā)育種子中CYP73A26的表達(dá)水平均較高。目前，CHC基因CYP73已被成功克隆和異源表達(dá)，并且CY P71～CY P75基因也已成功地在酵母中表達(dá)[34]。

苯丙烷類(lèi)生物合成途徑中的一個(gè)重要分支是可通過(guò)代謝產(chǎn)生異黃酮類(lèi)物質(zhì)。類(lèi)黃酮3，5羥化酶（F35H）和類(lèi)黃酮3羥化酶（F3H）分別通過(guò)（2S）-柚苷配基的B-環(huán)羥化作用和羥化柚皮苷和二氫山奈酚的B-環(huán)的3位置而生成的類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)。自1987年以來(lái)，學(xué)者們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，根據(jù)二者在不同物種中的控制位點(diǎn)不同，故在表達(dá)中產(chǎn)生花色不同的特點(diǎn)，在F35H和F3H可修飾花色方面做了大量的工作。

F35H作為第一個(gè)被克隆的CYP450基因已從矮牽牛、馬鞭草等植物中得到純化，主要調(diào)控花色素等物質(zhì)的合成。控制其功能的Hf1和Hf2位點(diǎn)使花色表達(dá)偏藍(lán)。在植物中，凡缺乏F35H

基因的物種，均不能形成藍(lán)色花。但F35H并不是形成藍(lán)色花色的唯一條件[35]。

現(xiàn)已從擬南芥、矮牽牛中克隆出編碼F3H的cDNA，它在矮牽牛中的表達(dá)特性、對(duì)花色的決定性和催化特性的研究表

明[36-39]：F3H在子房、花萼、花梗、莖和花藥中均表達(dá)，但在花冠伸長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)錄水平最高，同時(shí)，早期花瓣中F3H的轉(zhuǎn)錄水平高于發(fā)育成熟的花。研究人員從葡萄中克隆出4條F3H序列，但Southern雜交結(jié)果表明，F(xiàn)3H基因家族只有2個(gè)成員，其中F3H1

和F3H2只在根中微量表達(dá)，而F3H3和F3H4則在根、莖、葉、花和種子中均有較高水平的表達(dá)，因此認(rèn)為F3H1、F3H2和F3H3、F3H4分別是兩對(duì)等位基因。

在苯丙烷類(lèi)生物合成途徑中至少有16個(gè)CYP450參與催化反應(yīng)，其中大多數(shù)底物和產(chǎn)物對(duì)植物都有毒害作用，因此研究整個(gè)代謝途徑中CYP450的表達(dá)和調(diào)控，有助于進(jìn)一步闡明植物的分類(lèi)學(xué)和進(jìn)化學(xué)關(guān)系。

3.1.3 參與芥子油苷和生長(zhǎng)素合成的P450基因

近年來(lái)，從色氨酸到芥子油苷和生長(zhǎng)素的生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)是植物CYP450研究取得的顯著進(jìn)展之一。芥子油苷是由氨基酸衍生的天然產(chǎn)物，當(dāng)組織受到損傷時(shí)，存儲(chǔ)在液泡中的芥子油水解為某些腈和硫氰酸等一系列復(fù)雜的防御物質(zhì)，同時(shí)，芥子油苷和它的降解產(chǎn)物不僅可以作為抗癌藥物用于人體內(nèi)，并且可作為作物的保護(hù)劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。此外，生長(zhǎng)素作為植物生長(zhǎng)的促進(jìn)劑，在頂端優(yōu)勢(shì)、生根、維管組織的分化以及植物的熱激行為等方面均具有重要的作用。Bak[41]等研究證明（見(jiàn)圖2），生長(zhǎng)素和芥子油苷的生物合成具有相同的初始底物，但I(xiàn)AN在生長(zhǎng)素生物合成途徑中不是IAOx的中間產(chǎn)物。

用酵母篩選[42]證明了擬南芥的CYP79B2和CYP79B3可催化Trp合成芥子油甙的前體物吲哚乙醛肟（IAOx），而IAOx是合成生長(zhǎng)素的前體物質(zhì)。研究人員將CY P79B2基因在擬南芥中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)植物矮化、不育等生長(zhǎng)素過(guò)剩的表型，從而確定CYP79B2參與了Trp合成生長(zhǎng)素的反應(yīng)（如圖2）[43]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在擬南芥中CYP79A1和CYP79A2可分別催化Tyr和Phe，并最終生成芥子油甙。

3.2 參與植物解毒代謝的P450基因

植物在自然條件下生長(zhǎng)的過(guò)程中，常常受到病、蟲(chóng)、菌等的侵害；以及一些除草劑、殺蟲(chóng)劑和其他化學(xué)品的毒害。那么，存在于植物體內(nèi)的P450就會(huì)作為參與除草劑第1階段解毒過(guò)程中的關(guān)鍵酶[44，15]，通過(guò)催化作用，在接收到非生物脅迫和外源有機(jī)化合物毒害時(shí)，進(jìn)行毒性與非毒性化合物間的轉(zhuǎn)化，以此來(lái)抵抗各種外界壓力。1969年Frear等研究發(fā)現(xiàn)棉花幼苗微粒體中存在能夠代謝滅草?。╩onuron）的混合功能氧化酶，這直接證明了植物細(xì)胞色素P450酶系參與除草劑代謝并具有解毒功能[46]。目前，細(xì)胞色素P450參與部分種類(lèi)除草劑代謝已得到人們廣泛的認(rèn)可，且細(xì)胞色素P450在植物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)，可提高對(duì)不同作用機(jī)理的除草劑的抗性[47]，隨著研究的深入，分離參與除草劑降解的相關(guān)基因成了人們研究的熱點(diǎn)。

1993年首次從向日葵中得到了具有除草劑抗性的植物P450基因CYP73A1，該基因?qū)G麥?。╟hlorotoluron）有一定的催化代謝作用[48]。Robineau等[49]發(fā)現(xiàn)菊芋（Jerusalem artichoke）CYP76B1能代謝除草劑綠麥隆和利谷?。╨inuron），在煙草（Nicotiana tabacum）中表達(dá)的CYP76B1對(duì)綠麥隆和利谷隆的抗性分別增加了10倍和20倍。煙草CYP81B2、CYP71A11[50]和大豆（Gycine max）CYP71A10[51]也能代謝脲類(lèi)除草劑。在酵母中表達(dá)的小麥CYP71C6v1基因，表現(xiàn)出了對(duì)氯磺?。╟hlorsulfuron）和醚苯磺?。═riasulfuron）的5-羥基化酶活性，同樣也能催化甲磺?。╩etsulfuron-methyl）、芐嘧磺?。╞ensulfuron methyl）和苯磺?。╰ribenuron-methly）代謝為未知化合物[52]。Pang等[53]從水稻中分離到的由Bel基因編碼的CYP81A6，研究證實(shí)這種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞色素P450與水稻抗苯達(dá)松（bentazone）和磺酰脲類(lèi)除草劑有關(guān)。2002年Didierjean等[54]以從向日葵中克隆出的CYP76B1和P450還原酶的融合蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示，單獨(dú)的CYP76B1對(duì)除草劑的代謝能力比融合蛋白轉(zhuǎn)基因高。這意味著融合蛋白表達(dá)中蛋白的穩(wěn)定性下降導(dǎo)致其活性降低。由于除草劑的廣泛使用，現(xiàn)已成為生態(tài)環(huán)境的主要污染源，因此，利用CYP450對(duì)除草劑等人工合成物質(zhì)的代謝研究顯得尤為重要?？傊?，細(xì)胞色素CYP450作為與除草劑代謝密切相關(guān)的解毒酶，為除草劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和培育抗除草劑用的轉(zhuǎn)基因作物打下良好的基礎(chǔ)。

4 展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)日臻完善，越來(lái)越多的植物CYP450被分離，但它仍是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。其次，到目前為止，已成功分離的上萬(wàn)個(gè)CYP450中，只有極少數(shù)的基因功能被鑒定。因此以分離植物CYP450基因?yàn)榍疤幔?yàn)證與測(cè)定它們的生物化學(xué)功能是目前植物P450研究的焦點(diǎn)。另外，CYP450基因的表達(dá)調(diào)節(jié)主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，以及一些生物和非生物因子的調(diào)節(jié)，如光的誘導(dǎo)、組織器官的特異性和發(fā)育分化等因素的影響，因此植物CYP450基因的表達(dá)和調(diào)控也是今后一段時(shí)間的研究熱點(diǎn)。對(duì)于植物P450基因的研究，無(wú)論在理論上探索植物各種合成代謝途徑、選擇進(jìn)化，以及與環(huán)境的關(guān)系，還是在植物基因工程及作物改良中，包括參與創(chuàng)造雄性不育系、培養(yǎng)抗除草劑作物品種等方面都具有廣泛而深遠(yuǎn)的意義，這為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

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