王晗等

摘要[目的]研究臺灣金線蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)B5培養(yǎng)基的配方。[方法]以新鮮葉片為材料，經(jīng)過初代培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方。[結(jié)果]B5培養(yǎng)基中，影響懸浮培養(yǎng)因素的大小依次為大量元素濃度、6BA、2，4D、蔗糖、IAA。[結(jié)論]選用2%蔗糖、0.5 mg/L 6BA、0.2 mg/L IAA、0.6 mg/L 2，4D、1/2濃度大量元素的B5培養(yǎng)基培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，15 d后吸光度達(dá)4.425。

關(guān)鍵詞臺灣金線蓮；懸浮細(xì)胞；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

中圖分類號S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2014）36-12888-02

Abstract [Objective] To investigate B5 medium formula for suspension culture of Anoectochilus frmosanus Hayata cells. [Method] With fresh leaves as material， the culture system of suspension cells was established through primary culture， solid culture and subculture， and culture medium formula was optimized by orthogonal design. [Result] The influence factors of suspension culture in descending order were macroelement， 6BA，2，4D， sucrose， IAA. [Conclusion] The optimum conditions were 2% sucrose， 0.5 mg/L 6BA， 0.2 mg/L IAA， 0.6 mg/L 2， 4D， and semi concentration of macroelement， and culturing with optimal medium after 15 days， the optical density of suspension cells reached 4.425.

Key words Anoectochilus formosanus； Suspension cells； Culture medium； Culture conditions； Optimization

金線蓮 （Anoectochilus formosanus Hayata）為蘭科（Orchidaceae） 開唇蘭屬 （Anoectochilus BI） 中小型地生蘭，有滋補(bǔ)、止痛、鎮(zhèn)咳等功效，可用于治療肺結(jié)核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無力、遺精、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥[1-3]，從金線蓮中分離出的金線蓮苷（kinsenoside）具抗腫瘤、降血糖等生理活性[4-5]。野生野金線蓮主要分布在福建臺灣、廣東、廣西和西藏等地，由于其性喜陰涼、弱光、腐殖質(zhì)豐富的環(huán)境，加上自然的繁殖率低，所以野生資源極其稀缺，而采用大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，也許是解決這些問題有效的途徑之一[6-7]。筆者以新鮮葉片為材料，經(jīng)過初代培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

1材料與方法

1.1材料

臺灣金線蓮新鮮葉片采于組織培養(yǎng)瓶中生長旺盛的無菌苗，無菌苗由湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。試劑除植物激素為生化試劑，其余為分析純，購于杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.2儀器 HZ9310K恒溫光照培養(yǎng)搖床、UV1102II紫外可見分光光度計(jì)、NIB100倒置顯微鏡等。

1.3方法

1.3.1臺灣金線蓮懸浮培養(yǎng)體系的建立。

1.3.1.1初代懸浮培養(yǎng)。

取臺灣金線蓮葉片，蒸餾水分3次沖洗60 min，酒精70%～75%消毒15～30 s，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干材料表面水分后放入研缽中，加入緩沖液（20 μmol蔗糖、10 μmol MgCl2、20 μmol TrisHCl，pH=7.8）研磨數(shù)分鐘， 61 μm篩網(wǎng)過濾，濾液移入1.5 ml Ep管，離心（5 500 r/min，20 min），沉淀細(xì)胞轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間16 h/d、溫度25±1 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min。

1.3.1.2固體培養(yǎng)。

初代懸浮培養(yǎng)20 d后，取懸浮培養(yǎng)液過61 μm篩網(wǎng)，濾液離心（5 000 r/min， 3 min），沉淀細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度至104～105個/ml，與40 ℃左右的B5固體培養(yǎng)基搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，25 ℃光照培養(yǎng)20 d。

1.3.1.3繼代懸浮培養(yǎng)。

挑取固體培養(yǎng)基平板生長良好的細(xì)胞團(tuán)接入液體B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d、溫度25±1 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min。

1.3.2臺灣金線蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

采用L18（35）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]，考察B5培養(yǎng)基中大量元素、 蔗糖、吲哚3乙酸（Indole3acetic acid ，IAA）、6芐氨基嘌呤（6Benzylaminopurine， 6BA）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4Dichlorophenoxyacetic acid ，2，4D）不同濃度對臺灣金線蓮懸浮培養(yǎng)的影響，各因素的水平表及試驗(yàn)安排如表1～2所示。取繼代細(xì)胞接種于100 ml培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，483 nm波長測定吸光度。按照正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的培養(yǎng)基配方，配制5瓶100 ml培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)15 d，驗(yàn)證結(jié)果。

效果最好也驗(yàn)證這一點(diǎn)，至于1/4B5培養(yǎng)基效果差，可能與其營養(yǎng)水平過低有關(guān)。植物激素對植物細(xì)胞生長、分化再生及代謝產(chǎn)物的形成起到了重要的作用，該研究中使用了6BA、IAA 和2，4D 3種激素，研究結(jié)果表明激素對細(xì)胞生長速度的影響順序?yàn)?BA>2，4D>IAA，其中6BA對生物量的影響僅次于無機(jī)鹽，說明臺灣金線蓮生物量的高低與細(xì)胞分裂相關(guān)度較大。

參考文獻(xiàn)

[1]

馬志杰， 宏友. 民間藥材金線蓮研究動態(tài)[J].亞熱帶植物科學(xué)， 2002， 31（S1）：27-31.

[2] 鄭純， 黃以鐘， 潘馨.金線蓮的生藥鑒定[J].中藥材， 1997， 20（11）：522-524.

[3] 王振登， 楊春波.金線蓮中微量元素及氨基酸的分析測定[J].福建中醫(yī)報(bào)， 1993， 3（2）：100-101.

[4] 蔡金艷，張錦文，唐菲，等.金線蓮主要成分kinsenoside 的體外抗癌活性研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2010， 21（10）：2444-2445.

[5] 吳萍萍.金線蓮活性物質(zhì)分析及藥材質(zhì)量評價(jià)[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2013：1-77.

[6] SHIAU Y，AP SAGARE，CHEN U，et al.Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross pollination and in vitro culture of seeds[J].Bot Bull Acad Sin， 2002， 43：123-130.

[7] 陳裕.金線蓮生物學(xué)特性及生境特點(diǎn)的研究[J].亞熱帶植物通訊， 1994， 23（1）：18.

[8] 王國富， 王志忠.應(yīng)用統(tǒng)計(jì)[M]1 長沙：中南大學(xué)出版社，2003 ：44 - 671.

[9] 楊秀平， 劉莉麗.植物組織培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基的數(shù)量分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 19（5）：241-244.

[10] 吳春霞， 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響因素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009， 37（1）：36-38.

[11] DRAPEAU D，BLANCH H W，WILKE C R.Economic assessment of plant cell culture for the production of ajamalicine[J].Biotech Bioeng， 1987，30：946-953.

[12] 董燕， 刁玲武， 周聯(lián).藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的而影響因素[J].中醫(yī)藥信息，2011，28（3）：36-40.