黃成志　雷樹凡　胡景濤　呂直文　黃文章　嚴(yán)明建　冉彥秀

摘要[目的]通過降低試驗(yàn)藥劑、減少PCR循環(huán)時間、提高瓊脂糖利用指數(shù)等，建立經(jīng)濟(jì)、快速、低污染的雜交水稻純度鑒定體系。[方法]將雜交水稻萬優(yōu)481、親本萬3A和萬恢481在光照培養(yǎng)箱內(nèi)溫度發(fā)芽（30 ℃，長到5 cm左右），用CTAB法提取DNA；按優(yōu)化的PCR體系和電泳方法，用親本萬3A和萬恢481的DNA從24對引物中篩選出多態(tài)性好的引物P18，用引物P18對雜交水稻萬優(yōu)481樣本進(jìn)行純度鑒定。[結(jié)果]利用優(yōu)化的SSR分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確鑒定出萬優(yōu)481的純度為98.5%，與田間鑒定結(jié)果相符，凝膠電泳成像帶譜清晰，同時，與常用方法相比，酶等試驗(yàn)藥品使用量減少20%～25%，試驗(yàn)所用時間較常用方法減少了50%以上。[結(jié)論]利用優(yōu)化的SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系鑒定雜交水稻種子純度，經(jīng)濟(jì)、快速且鑒定的結(jié)果清晰、可靠，同時大大減少瓊脂糖等試驗(yàn)殘?jiān)漠a(chǎn)生，降低了對環(huán)境污染，值得推廣、應(yīng)用。

關(guān)鍵詞SSR分子標(biāo)記；雜交水稻；純度

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）22-07321-02

純度是雜交水稻種子質(zhì)量的核心指標(biāo)，是種子質(zhì)量分級的主要標(biāo)準(zhǔn)，是企業(yè)購銷種子的關(guān)鍵依據(jù)。準(zhǔn)確、快速鑒定雜交水稻種子的純度意義重大。然而，過去的田間鑒定需要大量的時間（至少90 d左右），隨著DNA分子標(biāo)記的興起，利用DNA分子標(biāo)記鑒定種子純度大大減少了試驗(yàn)時間，但用常用的PCR擴(kuò)增程序，做一板樣品（96個樣）仍需要2.5 h左右，凝膠電泳（96個樣）也需要1.5 h以上，并不能完全滿足目前高效的需要。SSR（Simple sequence repeats，簡單序列重復(fù)）標(biāo)記亦稱微衛(wèi)星（Microsatellite）標(biāo)記，已被廣泛用于各物種種群劃分、雜種優(yōu)勢預(yù)測和農(nóng)作物育種等領(lǐng)域[1-6]。隨著農(nóng)作物雜交種的廣泛推廣，SSR分子標(biāo)記已被廣泛用于水稻、玉米等雜交種子純度鑒定[7-10]。由于雜交水稻種子的廣泛應(yīng)用，市場上的品種數(shù)目繁多，種子純度鑒定工作量大、鑒定成本較高，筆者擬在常用SSR分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上，對試驗(yàn)耗材用量和PCR等過程進(jìn)一步優(yōu)化，以達(dá)到節(jié)約成本、節(jié)省時間的效果，探索一套快速、低耗的SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定體系，為雜交水稻種子純度鑒定提供快捷、可靠、低投入、少污染的方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院自制自繁種雜交水稻萬優(yōu)481及親本萬3A和萬恢481。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取。將雜交水稻萬優(yōu)481（500粒）、親本萬3A（20粒）和萬恢481（20粒）在光照培養(yǎng)箱內(nèi)30 ℃下發(fā)芽至5 cm左右，然后用CTAB法提取DNA。

1.2.2PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及電泳方法的優(yōu)化設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系：20 ml體系包括dNTP 1.6 ml、PCR buffer2.0 ml、引物2.0 ml、模板DNA2.0 ml、Taq酶0.15 ml、水12.25 ml。

PCR反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃15 s，35個循環(huán)； 72 ℃ 3 min。

電泳方法優(yōu)化：36孔子4排（24孔梳子4排），2次點(diǎn)樣檢測288個樣（一次點(diǎn)樣96個樣）。

1.2.3篩選引物。利用親本萬3A、萬恢481的DNA從24對引物中篩選出多態(tài)性好的引物P18，供試驗(yàn)使用。

1.2.4萬優(yōu)481純度鑒定。利用篩選出來的引物P18對萬優(yōu)481群體經(jīng)過PCR、瓊脂糖凝膠電泳、成像，最后讀帶、統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算出該批種子的純度。

2結(jié)果與分析

2.1純度鑒定結(jié)果用優(yōu)化的SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對500株萬恢481植株苗進(jìn)行純度鑒定，經(jīng)讀帶統(tǒng)計(jì)，該批種子純度為98.5%，與田間鑒定結(jié)果相符。

2.2優(yōu)化的SSR分子標(biāo)記技術(shù)試驗(yàn)效果利用優(yōu)化的SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行引物篩選和純度鑒定，最后成像帶譜均較為清晰（圖1），能夠清楚地讀出帶譜，完全可以滿足雜交水稻種子純度鑒定工作。圖1優(yōu)化后的電泳成像效果2.3PCR耗材及效率分析在試驗(yàn)耗材方面，優(yōu)化后的PCR體系較常用體系節(jié)省了20%的dNTP、20%的PCR buffer和25%的Taq酶，大幅降低了試驗(yàn)成本。

在試驗(yàn)用時上，利用優(yōu)化后的反應(yīng)程序擴(kuò)增一板PCR只需要60 min，而常用反應(yīng)程序擴(kuò)增一板PCR則需要150 min左右，即利用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)程序可以大大減少試驗(yàn)時間，提高了工作效率。

2.4電泳效率及瓊脂糖利用指數(shù)分析傳統(tǒng)的電泳方法，一次制膠只能做96個樣品，用時90 min左右，折合1.07個/min樣品，而優(yōu)化后，一次制膠可以做出288個樣品，用時130 min，折合2.22個/min樣品，優(yōu)化后的電泳效率為常用方法2倍多。同時大大減少制膠次數(shù)，節(jié)省了制膠所用成本。