趙洪良 趙連魁 李冬軍 鄭文立 楊高松 李明

[摘要]目的：探討新的自體表皮細胞懸液制取方法。方法：選取30只大鼠，應用切削皮法結合胰蛋白酶和組織微粒法結合中性蛋白酶/胰蛋白酶法兩種技術獲得自體表皮細胞懸液并進行細胞產(chǎn)量和活力的比較。結果 實驗組整個操作約1h內(nèi)即可完成，而對照組則需要1.5天的時間。實驗組活細胞率0.966±0.35，對照組活細胞率0.971±0.42，兩組間比較無明顯差異（P>0.05）。細胞產(chǎn)量：實驗組（1.5±0.52）×106，對照組（1.9±0.72）×106，兩組間比較有無差異（P>0.05）。結論：切削皮法結合胰蛋白酶法制取表皮細胞懸液，制取的表皮細胞懸液的產(chǎn)量和活力與組織微粒法結合中性蛋白酶/胰蛋白酶法比較無顯著差異，但操作簡單和耗時少。

[關鍵詞]表皮細胞；懸液；細胞活力； 胰蛋白酶

[中圖分類號]R62 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）19-1615-03

自體皮片移植是皮膚創(chuàng)面修復的重要手段，供皮區(qū)的瘢痕、感染和色素異常并發(fā)癥的難題一直未得到解決，尤其大面積深度燒傷患者因為供皮區(qū)域限制等問題，促進了自體表皮細胞懸液的出現(xiàn)，并開始應用于創(chuàng)面治療，但是臨床應用效果不佳[1]。1975年培養(yǎng)自體表皮細胞成功[2]，由于培養(yǎng)的自體表皮細胞不但需要2周左右實驗室培養(yǎng)時間，而且需要昂貴的實驗室和技術熟練的專業(yè)人員，最重要的是經(jīng)過培養(yǎng)的表皮細胞成功移植后存在組織脆弱，抗感染能力差等問題，所有這些缺陷限制了其臨床應用[3-4]。因此開發(fā)一種技術簡單，耗時少、產(chǎn)量高和活力好的自體表皮細胞懸液制取方法是燒傷和整形外科的研究熱點。本研究對切削皮結合胰蛋白酶法和組織微粒結合中性蛋白酶/胰蛋白酶法兩種技術獲得自體表皮細胞懸液進行了比較，為臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1動物與分組：選取成年健康 Wistar 大鼠 30 只，體重200～300g，雌雄各半，術前禁食6h，予以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉（供皮區(qū)選擇正常的背部兩側皮膚，固定好大鼠，消毒后，刮除背部鼠毛，形成約2cm×2cm無毛區(qū)，周圍用膠帶粘貼。用碘伏常規(guī)消毒正常皮膚3次，設計切取皮片范圍1.0cm×1.0cm，皮下注射生理鹽水使供皮區(qū)皮膚明顯腫脹并形成一個相對的平面，取無菌一次性剃須刀片，中號直血管鉗夾刀片，切下表皮，取皮片的厚度在切削時應密切觀察?；蛘咻佪S取皮刀切取刃厚皮片，取下的皮片立即放于生理鹽水浸洗3遍備用，供皮創(chuàng)面，無菌凡士林油紗覆蓋，無菌敷料加壓包扎。

1.2酶消化：實驗組：無菌條件下，將浸洗后皮片放入無菌容器中，組織剪簡單剪碎皮片至1.0mm×1.0mm，加入適量無菌0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液，37℃消化20min后，無菌條件下離心收集上層表皮細胞懸液。對照組采用，無菌皮片浸于Dipase I 溶液，4℃消化過夜，鑷子分離表皮細胞，生理鹽水漂洗3遍，0.25%胰蛋白酶和 0.01% EDTA混合液，37℃消化10min，吸管反復吹打分散細胞，收集表皮細胞懸液[5]。

1.3細胞活力測定：細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9：1混合混勻。在3min內(nèi)，分別計數(shù)活細胞和死細胞。OlympusIX71倒置顯微鏡鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。血球計數(shù)板法進行細胞計數(shù)，并統(tǒng)計細胞活力：活細胞率（%）= 活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100%。

1.4統(tǒng)計學方法：采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，兩組設計的計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料用百分率表示，率的比較采用 χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1無菌條件下，實驗組整個操作約1h內(nèi)即可完成，而對照組則需要1.5天的時間，所獲得的表皮細胞懸液中均含有表皮細胞，黑色素細胞和朗罕氏細胞。

2.2細胞活力：實驗組活細胞率0.966±0.35，對照組活細胞率0.971±0.42， 兩組間比較無明顯差異（P>0.05，如圖1）。

4.3 細胞產(chǎn)量：實驗組（1.5±0.52）×106，對照組（1.9±0.72）×106，兩組間比較有無差異（P>0.05，如圖2）。

3 討論

表皮細胞懸液不僅可用于創(chuàng)面治療，而且應用于白癜風等皮膚疾病的治療，因此制取表皮細胞懸液的方法相關研究是燒傷和整形外科研究熱點之一。綜合文獻報道的制取方法，目前主要步驟包括：取皮，剪碎，酶消化和獲得表皮細胞懸液[4-6]。

首先，取皮方法主要有負壓取皮，剃須刀切削法取皮，輥軸刀或者電動取皮刀取皮，手術刀切取全厚皮等。負壓取皮法盡管損傷小，但是操作復雜，耗時長，并且移植后表皮細胞總成活率低，是因為負壓吸皰對表皮角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的生理功能造成了一定的影響，影響了移植后細胞的存活[7]。至于手術刀切取全厚皮，損傷重以及不適合大面積取皮等缺點而限制了其的應用。而應用切削法直接切下薄層表皮，表皮細胞的各種生理功能并未受到影響，而且操作時間短。故本研究中采用該方法順利取得皮膚標本，但操作過程中都要注意掌握深度，表皮移植術后應盡量減少運動，以免影響表皮細胞的成活。

其次，酶消化技術。中性蛋白酶結合胰蛋白酶二步法是獲得培養(yǎng)表皮細胞實驗室常用的方法，該方法需要在特定的細胞培養(yǎng)間首先用中性蛋白酶分離表皮和真皮，這個過程需要一個較長的時間，然后用胰蛋白酶消化表皮后即可得到表皮細胞懸液。該方法對實驗室的設備和人員要求較高，操作步驟復雜，耗時長，在臨床應用受到很大的限制，此外，該產(chǎn)品價格昂貴限制了臨床應用。

Recell技術是近年來出現(xiàn)的新方法之一[8]，該方法是消化表皮真皮連接區(qū)的真皮面的表皮細胞制取懸液應用于臨床，僅僅只獲取了標本中一部分有活性的細胞成分，制取表皮細胞懸液，浪費了較多的皮膚標本，本研究改進了表皮細胞懸液的制取方法，利用組織剪制成組織微粒的簡單步驟使胰蛋白酶與皮膚微粒結合更充分，更加有利于表皮細胞的分離。這個過程中掌握消化的時間至關重要，消化時間過長則影響表皮細胞活性，時間過短則表皮細胞不能充分游離。

最后， 表皮細胞懸液的產(chǎn)量和活力。經(jīng)過本方法消化的表皮細胞懸液中細胞的產(chǎn)量與中性蛋白酶結合胰蛋白酶法的表皮細胞產(chǎn)量比較無明顯統(tǒng)計學差異，而且兩組活細胞率比較無明顯差異。此外，本方法耗時少，方法簡單，無菌手術間即可完成操作，這提高了臨床應用的前景。

綜上所述，切削皮法結合胰蛋白酶法制取表皮細胞懸液，制取的表皮細胞懸液的產(chǎn)量和活力與中性蛋白酶/胰蛋白酶法比較無顯著差異，但技術簡單，容易操作，耗時少，因此具有良好應用前景。

[參考文獻]

[1]Billingham RE，Reynolds J. Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions [J].Br J Plast Surg，1952，5：25-36.

[2]Rheinwald JG，Green H.Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes：the formation of keratinizing colonies from single cells[J].Cell，1975 ，6（3）：331-343.

[3]Woodley DT，Peterson HD，Herzog SR，et al. Burn wounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils[J]. JAMA，1988，17：2566-2571.

[4]Wood FM，Kolybaba ML，Allen P.The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn wounds：Eleven years of clinical experience [J].Burns，2006，32： 538-544.

[5]吳昌炎，房志強，江寶華，等.自體表皮細胞懸液在修復皮膚組織缺損創(chuàng)面中的作用研究[J].中國美容醫(yī)學，2012，21（12）：2201-2203.

[6]張大維，樹瑜.白癜風西醫(yī)治療的研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2009，18（5）：730-733.

[7]李金勇，董愛麗，郭丙辰.自體表皮移植治療白癜風供皮區(qū)兩種取皮方法的比較[J].中國麻風皮膚病雜志，2008，24（10）：798-799.

[8]Wood FM，Giles N，Stevenson A，et al. Characterisation of the cell suspension harvested from the dermal epidermal junction using a ReCell kit [J].Burns，2012， 38：44-51.

[收稿日期]2014-07-31 [修回日期]2014-08-26

編輯/何志斌