曾小玲 方淑桂 朱朝輝 鐘開勤

福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建福州 350111

摘 要 以11個(gè)不同基因型的菜心栽培品種為試材，研究不同培養(yǎng)條件對菜心游離小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生的影響。結(jié)果有7個(gè)基因型材料獲得小孢子胚，從不同基因型誘導(dǎo)形成胚的頻率存在顯著差異，表明基因型是影響菜心小孢子胚發(fā)生的主要因素；第1天熱激培養(yǎng)時(shí)用170 g/L高濃度蔗糖培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)換成含130 g/L蔗糖培養(yǎng)基能顯著提高小孢子胚誘導(dǎo)率；0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促進(jìn)菜心小孢子誘導(dǎo)成胚；添加0.4 mg/L GA3可顯著提高菜心小孢子胚芽誘導(dǎo)率和平均每胚出芽數(shù)。7個(gè)基因型材料均誘導(dǎo)出再生植株，植株誘導(dǎo)率為100%。

關(guān)鍵詞 菜心；游離小孢子培養(yǎng)；基因型；植株再生

中圖分類號(hào) S634 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var.utilis Tsen et Lee.）是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的1個(gè)變種。其適應(yīng)性強(qiáng)，可周年栽培，在我國南方大面積種植。菜心雜交育種研究起步晚，常規(guī)育種方法需經(jīng)過雜交、回交和多代自交分離，選育出理想的純系需要5～6年的時(shí)間。通過游離小孢子培養(yǎng)能夠快速獲得大量雙單倍體植株（DH系），將顯隱性基因成為表現(xiàn)型，使優(yōu)良性狀得到保留，大大縮短育種的年限，豐富育種資源，是一種快速、高效的育種途徑。國內(nèi)外研究人員對蕓薹屬蔬菜小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制和影響因素做了大量研究，相繼在蕓薹屬的多個(gè)種[1-8]上獲得成功。但是不同種間游離小孢子胚誘導(dǎo)各有其自身的規(guī)律，不能完全相互套用。有關(guān)菜心游離小孢子培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，朱允華等[9]僅從個(gè)別菜心基因型誘導(dǎo)出胚狀體，沒有形成再生植株。目前，菜心小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系尚不完善，仍然有大量的具體問題需要探索。本試驗(yàn)通過對11個(gè)基因型菜心進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，對影響菜心胚誘導(dǎo)率和植株再生技術(shù)的幾個(gè)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行探討，培育出小孢子再生植株，進(jìn)一步完善菜心小孢子培養(yǎng)技術(shù)，為利用現(xiàn)有資源快速創(chuàng)造所需要的新育種材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

11個(gè)供試材料分別為‘翠綠（福州永榮種子有限公司）、‘東莞2號(hào)（福州臺(tái)農(nóng)種業(yè)有限公司）、‘優(yōu)選38號(hào)（武漢武昌神牛種苗商行）、‘華綠50天（廣州華綠種子有限公司）、‘翡翠（廣州市惠金農(nóng)業(yè)科技有限公司）、‘綠寶（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）、‘一枝花（廣州廣南農(nóng)業(yè)科技有限公司）、‘501（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）、‘翡翠尖葉（廣州市惠金農(nóng)業(yè)科技有限公司）、‘青翠（廣東省良種引進(jìn)服務(wù)公司）和‘碧綠（深圳市范記種子有限公司），均為常規(guī)種。2009年1月10日、2月28日、8月2日，2010年1月8日、2月23日、8月7日2年6批直播于福州市蔬菜科學(xué)研究所試驗(yàn)田，常規(guī)管理，2中旬至4月和9月選取適宜花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 游離小孢子的分離、純化和培養(yǎng) 參照方淑桂等[10]的研究方法對菜心游離小孢子進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)。在菜心的始花期，于上午9 ： 00前，選取無蟲眼的供試花蕾（蕾長2.0～3.0 mm，瓣藥比為1/3～4/5），先用75%酒精蕩洗20 s，再用有效氯含量≥8.0%的13%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，最后用無菌水蕩洗3次；挑取花蕾于研缽中，加入含蔗糖130 g/L高溫滅菌過的B5培養(yǎng)基，用研杵擠壓游離出小孢子，經(jīng)孔徑50 μm的尼龍網(wǎng)布過濾收集在10 mL的玻璃離心管中；于1 000 r/min的離心機(jī)離心3 min，棄上清液，再加入10 mL的B5液體培養(yǎng)基懸浮小孢子，離心，棄上清液，重復(fù)3次；純化的游離小孢子懸浮培養(yǎng)于NLN13液體培養(yǎng)基中，以每皿3 mL分裝到60 mm×15 mm的無菌培養(yǎng)皿中，用Parafilm膜封口；將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱33 ℃熱激誘導(dǎo)24 h，之后轉(zhuǎn)入25 ℃靜止暗培養(yǎng)，至胚狀體出現(xiàn)。培養(yǎng)23 d后統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)，計(jì)算出胚率。當(dāng)幼胚開始轉(zhuǎn)綠即轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基中，置于（25±1）℃、光強(qiáng)3 000 lx、光照14 h/d條件下培養(yǎng)。

1.2.2 小孢子發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)的游離小孢子每天置于OLYMPUS-CX41倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 不同氣候條件對小孢子胚誘導(dǎo)的影響 以易出胚的基因型‘翠綠、‘翡翠尖葉為材料，記錄取樣前一天的氣溫，將出胚結(jié)果與取樣前一天的溫度對應(yīng)，分析溫度對菜心出胚的影響，氣象資料由福州市氣象局提供。

1.2.4 不同蔗糖濃度對小孢子胚發(fā)生的影響 分別以難出胚基因型‘青翠、中等出胚基因型‘碧綠和‘優(yōu)選38號(hào)、易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉為材料，參照于文佳等[11]的方法，將游離的小孢子進(jìn)行3種方式處理：1）一直用含130 g/L蔗糖的NLN13培養(yǎng)基培養(yǎng)；2）用含130 g/L蔗糖的NLN13培養(yǎng)基熱激1 d后，重新離心更換為新鮮的含130 g/L蔗糖的NLN13培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；3）用含170 g/L蔗糖的NLN13培養(yǎng)基熱激1 d后，重新離心更換為含130 g/L蔗糖的NLN13培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)處理5皿，重復(fù)3次。23 d后統(tǒng)計(jì)小孢子的出胚數(shù)。

1.2.5 6-BA和NAA對小孢子胚誘導(dǎo)的影響 以中出胚基因型‘優(yōu)選38號(hào)和難出胚基因型‘青翠單核晚期的花蕾為材料，將純化的小孢子分別懸浮在含不同質(zhì)量濃度6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）（0.05、0.10、0.15 mg/L）和NAA（萘乙酸）（0.2、0.5、1.0 mg/L）組合的NLN13液體培養(yǎng)基（含蔗糖130 g/L）中培養(yǎng)。23 d后統(tǒng)計(jì)小孢子的出胚數(shù)。

1.2.6 激素對小孢子胚芽繼代的影響 由于擴(kuò)繁需要，研究不同質(zhì)量濃度的激素對再生芽的影響。采用L9（34）拉丁方設(shè)計(jì)，將‘碧綠獲得的小孢子胚狀體分別接種在含不同質(zhì)量濃度6-BA（0.8、0.4、0 mg/L）、NAA（0.04、0.02、0 mg/L）和GA（0.8、0.4、0 mg/L）組合的9組固體培養(yǎng)基中（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MS+30.0 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂），23 d后統(tǒng)計(jì)菜心的胚芽誘導(dǎo)率。胚芽誘導(dǎo)率=出芽胚狀體數(shù)/接種胚狀體數(shù)×100%，平均每胚出芽數(shù)=再生芽總數(shù)/出芽胚狀體數(shù)。

1.2.7 小孢子胚芽的生根及馴化移栽 再生芽長至2 cm左右時(shí)，切下芽，并轉(zhuǎn)入生根固體培養(yǎng)基（1/2MS+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂）中生根，長成小苗，植株經(jīng)馴化后移栽到苗床。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DPS6.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，Graphpad5.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子離體培養(yǎng)過程的形態(tài)學(xué)觀察

從OLYMPUS-CX41倒置顯微鏡觀察菜心游離小孢子發(fā)育過程的形態(tài)變化。剛游離的小孢子大部分呈近圓形，具有3條萌發(fā)溝，細(xì)胞核被大液泡擠到細(xì)胞一側(cè)，處于單核靠邊期。經(jīng)熱激誘導(dǎo)處理1 d后，部分小孢子明顯膨大，細(xì)胞增大到原來的2倍左右，形狀為圓球形（圖1-a）。3 d后，部分膨大的小孢子開始第一次細(xì)胞分裂，再經(jīng)橫向和縱向多次分裂，培養(yǎng)7 d分裂形成細(xì)胞團(tuán)。10～16 d細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育形成球形胚、心形胚（圖1-b）、魚雷形胚、子葉胚，最后形成不同形狀的胚狀體（圖1-d）。部分膨大的小孢子為橫向均等分裂，繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞團(tuán)（圖1-c），逐漸形成肉眼可見的愈傷組織，這些愈傷組織的細(xì)胞之間松散而無序的連接在一起?？梢姴诵挠坞x小孢子發(fā)育過程存在胚狀體途徑和愈傷組織途徑的2種不同途徑。

2.2 不同基因型小孢子胚誘導(dǎo)的差異比較

由表1可見，供試的11份材料中有7個(gè)基因型誘導(dǎo)出胚，占63.6%。其中‘翠綠和‘翡翠尖葉每蕾出胚數(shù)較高，分別為8.06胚/蕾和6.28胚/蕾；‘東莞2號(hào)、‘青翠和‘華綠50天的出胚數(shù)相對低些，均在1.50胚/蕾以下；‘翡翠、‘501、‘綠寶和‘一枝花在NLN13培養(yǎng)基中未誘導(dǎo)出胚，不同基因型的菜心小孢子出胚數(shù)有極顯著差異。根據(jù)小孢子出胚數(shù)的不同，可以把11個(gè)材料劃分為4類：易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉，平均出胚數(shù)大于5.0胚/蕾；中等出胚基因型‘碧綠和‘優(yōu)選38號(hào)，平均出胚數(shù)為1.5～5.0胚/蕾；難出胚基因型‘東莞2號(hào)、‘青翠、‘華綠50天，平均出胚數(shù)為0～1.5胚/蕾；不能出胚基因型‘翡翠、‘501、‘綠寶和‘一枝花。在不能出胚的4個(gè)基因型中，觀察到‘一枝花的游離小孢子發(fā)生膨大和分裂，說明其具有產(chǎn)生胚狀體的潛力，可能是培養(yǎng)基中的某些外因抑制細(xì)胞團(tuán)的繼續(xù)發(fā)育；‘501只觀察到細(xì)胞的膨大，說明‘501基因型對培養(yǎng)條件有一定的反應(yīng)，但是細(xì)胞不能進(jìn)一步分裂。在相同的處理?xiàng)l件下，游離小孢子胚的發(fā)生能力是受基因型調(diào)控的。

2.3 供體植株氣候條件對小孢子胚誘導(dǎo)的影響 由表2可見，供體植株的氣候條件對小孢子胚的誘導(dǎo)具有明顯影響。植株在夜間最低氣溫低于10 ℃和日間最高氣溫高于30 ℃條件下，小孢子誘導(dǎo)率大大降低。在夜間最低氣溫處于12 ℃左右，日間最高氣溫處于24 ℃左右胚誘導(dǎo)率較高，這段時(shí)間比較適合菜心游離小孢子培養(yǎng)。2月份和3月份的胚誘導(dǎo)強(qiáng)于9月份，9月份的出胚數(shù)量極少。

2.4 培養(yǎng)基的蔗糖濃度對菜心小孢子胚誘導(dǎo)的影響

圖2顯示，不同蔗糖濃度處理對難出胚基因型‘青翠、中出胚基因型‘碧綠和‘優(yōu)選38號(hào)的出胚數(shù)造成極顯著差異，但對易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉則無顯著影響。其中對于難出胚基因型‘青翠，處理1和處理2不能誘導(dǎo)形成胚，處理3則能夠誘導(dǎo)形成胚，且出胚數(shù)達(dá)到每蕾0.97個(gè)；對于中出胚基因型‘碧綠和‘優(yōu)選38號(hào)，處理1和處理2能夠不同程度地提高小孢子出胚數(shù)，以處理3效果最好，出胚數(shù)比處理1每蕾分別多2.72個(gè)和2.73個(gè)；易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉對高糖處理的影響不大，處理3分別比處理1每蕾僅多0.29個(gè)和0.16個(gè)。

2.5 6-BA和NAA對小孢子胚誘導(dǎo)的影響

表3表明，添加適宜質(zhì)量濃度配比的生長調(diào)節(jié)劑有利于提高菜心游離小孢子的產(chǎn)胚量，其中對不易出胚基因型的促進(jìn)作用更加明顯?！畠?yōu)選38號(hào)的產(chǎn)胚數(shù)從每花蕾1.06個(gè)增加到3.77個(gè)，提高了2倍多。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA促進(jìn)了難出胚基因型‘青翠誘導(dǎo)出胚。菜心誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最適宜激素質(zhì)量濃度配比是0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA。說明生長調(diào)節(jié)劑是影響小孢子胚發(fā)生的重要因素之一，不同基因型要求的植物激素組合和濃度不盡相同。

2.6 激素對胚狀體繼代的影響

將‘翠綠培養(yǎng)得到的生長良好的轉(zhuǎn)綠胚狀體（圖3-a）轉(zhuǎn)接到MS固體培養(yǎng)基上擴(kuò)繁培養(yǎng)，產(chǎn)生叢生芽。經(jīng)試驗(yàn)研究（表4），在MS固體培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA和GA3都能誘導(dǎo)出不定芽，胚芽誘導(dǎo)率在2.41%～58.53%，平均每胚出芽數(shù)在0.69～6.61，不同質(zhì)量濃度激素組合處理間呈極顯著差異。其中添加0.4 mg/L GA3最有利于不定芽發(fā)生，胚芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到58.53%，平均出芽數(shù)為每胚6.61個(gè)，比其他處理形成的植株較粗壯（圖3-b），再經(jīng)過2～3次繼代后進(jìn)行生根培養(yǎng)形成小孢子幼苗。只添加NAA的繼代培養(yǎng)基中，胚芽誘導(dǎo)率最低，有些胚狀體在培養(yǎng)過程形成愈傷，最終褐化死亡（圖3-c）。添加6-BA和NAA的繼代培養(yǎng)基中，菜心小孢子的胚芽發(fā)生速度較慢，植株較弱，胚芽誘導(dǎo)率偏低。逐漸提高GA3的濃度，菜心胚芽的分化受到明顯抑制，在添加0.8 mg/L GA3的MS培養(yǎng)基中，菜心葉子慢慢變大變厚，形成很多次生胚。將幼苗轉(zhuǎn)接到1/2MS+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得健壯的植株（圖3-d）。由此可見，適宜的激素濃度對不定芽的再生具有明顯促進(jìn)作用，激素濃度過高或不適宜都會(huì)抑制胚芽的擴(kuò)繁。菜心小孢子胚芽繼代的最適培養(yǎng)基是MS+0.4 mg/L GA3。

3 討論與結(jié)論

菜心基因型是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一。在相同處理?xiàng)l件下，供試的11個(gè)基因型材料中有7份形成了小孢子胚，誘導(dǎo)成功率為63.6%，表明菜心的基因型決定了出胚率，基因型的反應(yīng)范圍較高，這與前人[12-13]的研究結(jié)果相同。在實(shí)際工作中可以將容易培養(yǎng)的基因型與難培養(yǎng)的基因型雜交，通過遺傳改良的方法擴(kuò)大小孢子胚胎發(fā)生的基因型范圍，獲取有用的基因。這種設(shè)想陳文輝等[14]在甘藍(lán)上進(jìn)行了嘗試，并獲得了成功。在菜心上的應(yīng)用目前還沒有報(bào)道，有待于今后的摸索，實(shí)現(xiàn)對優(yōu)良性狀基因型的成功培養(yǎng)。

植株的生長環(huán)境也是影響小孢子培養(yǎng)成敗的因素之一，健康生活力強(qiáng)的供試植株是小孢子培養(yǎng)的基礎(chǔ)，植株生長環(huán)境如氣溫、光周期和光照條件影響胚或胚狀體的產(chǎn)量[15]。多數(shù)蕓薹屬植物生長在較低溫（日/夜，10 ℃/5 ℃）有利于小孢子的培養(yǎng)[16-17]。張鳳蘭[18]發(fā)現(xiàn)生長在14～18 h長日照，15～20 ℃條件下的大白菜‘HoMei植株，胚狀體發(fā)生率和植株再生率高。方淑桂等[19]證實(shí)在10～25 ℃下生長的大白菜植株有利于小孢子培養(yǎng)。菜心多數(shù)品種對光周期要求不嚴(yán)格，花芽分化主要受溫度影響。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明當(dāng)晝夜氣溫在12～24 ℃時(shí)菜心胚誘導(dǎo)率較高，在夜溫低于10 ℃或日溫高于30 ℃時(shí)均不利于菜心游離小孢子的出胚；春季的夜溫比秋季的夜溫低，導(dǎo)致小孢子培養(yǎng)時(shí)的脫分化能力的提高。推測氣溫變化會(huì)改變小孢子的內(nèi)源激素水平從而影響胚的發(fā)生，影響了小孢子發(fā)育的方向。菜心植株應(yīng)在適宜大田溫度條件或在人工氣候室中栽培有利小孢子培養(yǎng)工作開展。

培養(yǎng)基中蔗糖的供應(yīng)對小孢子的發(fā)生起著碳源、能源和調(diào)節(jié)滲透壓的重要作用，在小孢子培養(yǎng)研究中前人[20-21]多有討論。方淑桂等[21]研究花椰菜游離小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)表明太高或太低蔗糖濃度都不利于小孢子存活，胚誘導(dǎo)頻率最高的培養(yǎng)基蔗糖為130 g/L。本試驗(yàn)游離小孢子熱激培養(yǎng)1 d時(shí)采用含170 g/L蔗糖的培養(yǎng)基，之后更換為含130 g/L蔗糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，青翠等不易出胚基因型的游離小孢子培養(yǎng)反應(yīng)比較積極，小孢子膨大快，小孢子的出胚數(shù)得到顯著的提高；可能是剛游離的小孢子需要高濃度蔗糖來保持滲透壓，之后轉(zhuǎn)入低濃度蔗糖是促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)一步分裂。

現(xiàn)在越來越多的試驗(yàn)證明添加適當(dāng)濃度的激素可以促進(jìn)細(xì)胞生長、分裂和不定芽的形成。馮輝等[22]研究了NAA和6-BA的不同質(zhì)量濃度配比對胚誘導(dǎo)、胚再生、植株生根的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素組合和濃度對不同基因型小孢子出胚數(shù)的影響有顯著差異，在NLN13誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA能夠極顯著的誘導(dǎo)小孢子出胚數(shù)；繼代培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度GA3可以促進(jìn)菜心胚芽長成數(shù)量多的不定芽，但高質(zhì)量濃度的GA3對小孢子胚的繼代產(chǎn)生有抑制作用。

總之，影響小孢子培養(yǎng)和再生植株獲得的因素很多[23-26]，菜心小孢子培養(yǎng)技術(shù)需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證，以便加快應(yīng)用于生產(chǎn)。

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