包杰等

摘 要 橡膠樹無性系株間產(chǎn)量存在明顯差異是導致產(chǎn)量育種選擇周期長的主要原因之一。橡膠樹的產(chǎn)量主要取決于產(chǎn)膠能力和排膠能力2個因素。樹干樹皮中的次生乳管數(shù)量及乳管細胞內(nèi)的天然橡膠生物合成效率與產(chǎn)膠能力直接相關(guān)。從次生乳管分化和橡膠合成關(guān)鍵因子基因表達2個層面對無性系株間產(chǎn)膠能力的一致性進行分析。結(jié)果表明：樹皮最內(nèi)石細胞群以內(nèi)次生乳管列數(shù)與次生韌皮部厚度的比值具有品系特征；在同一品系中，該比值的株間差異小，表現(xiàn)出良好的一致性。8 a割齡大樹該比值的株間一致性較3 a幼樹差，而在3 a幼樹中，樹高40 cm處該比值的株間一致性比樹高100 cm處更好。因此，以3 a幼樹樹高40 cm處的該比值作為產(chǎn)量育種早期篩選標記較合適。膠乳中MYC1、HRT2基因的表達量在割膠后上調(diào)，并且具有品系特征，但這2個基因的表達量在株間的一致性較差，故在產(chǎn)量育種早期篩選中只能起到輔助作用。

關(guān)鍵詞 橡膠樹無性系；產(chǎn)膠能力；石細胞；次生乳管；MYC1/HRT2基因表達

中圖分類號 S667. 3 文獻標識碼 A

Abstract The obvious difference of latex yield in rubber tree clones is one of the main reasons leading to the long selection cycle in yield breeding. It is well known that the latex yield of rubber tree depends on the ability of latex biosynthesis as well as latex flow， and the latex biosynthesis is determined by two key factors， one of which is the amount of secondary laticifer line in bark and the other is the effeciency of latex regeneration in laticifers. From secondary laticifer differentiation and key gene expression of rubber biosynthesis two aspects， the consistency of latex production capacity in rubber tree clones was studied. The results showed that the ratio of the number of secondary laticifer lines and the thickness of phloem within the innermost stone cell group was a feature closely related with the clones. The standard error of aforementioned ratio much less than the laticifer line number showing well consistency of the ratio in clones. Moreover， the ratio and its standard error changed according to the tree-age and the height of tree. Usually， consistency of the ratio in bark of rubber tree exploited for 8 years was inferior to the 3 years old tree， in which， however， consistency of the ratio in the bark at 40 cm height was better than 100 cm height. So， the ratio of bark at the height 40 cm for 3-year old could be used as an early screening marker for yield breeding. Gene expression of MYC1 and HRT2， possessing clone characteristic， was upregulated after tapping. However， the consistence of expression was low among clones. We proposed that the expression of the two genes may act as an assistant marker in the yield breeding.

key words Rubber tree clones；Rubber production capacity；Stone cells；Secondary laticifer；MYC1/HRT2 gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.013

橡膠樹的產(chǎn)量形成受多種因素的影響，產(chǎn)量育種周期長，篩選產(chǎn)量早期選擇指標對于縮短育種年限及發(fā)展天然橡膠產(chǎn)業(yè)具有重要意義。橡膠樹樹干樹皮中的次生乳管數(shù)量、2次割膠間的膠乳再生（主要是橡膠生物合成）和排膠持續(xù)時間是決定天然橡膠產(chǎn)量的3個關(guān)鍵因子[1]。前2個因子與產(chǎn)膠能力相聯(lián)系，后一個因子反映了橡膠樹的排膠能力。維管形成層的紡錘狀原始細胞分化形成次生乳管，因此維管形成層分化乳管的能力直接決定次生乳管的數(shù)量。最內(nèi)層石細胞群以內(nèi)的次生乳管列的數(shù)量與次生韌皮部厚度的比值反映了形成層細胞分化次生乳管的能力，而且與膠乳產(chǎn)量是顯著正相關(guān)[2]。天然橡膠的生物合成是一種典型的植物類異戊二烯代謝，其關(guān)鍵酶是橡膠轉(zhuǎn)移酶（HRT）[3-6]。茉莉酸對植物次生代謝有重要的調(diào)節(jié)作用[7-9]。近年來，關(guān)于植物茉莉酸信號途徑的研究取得了明顯進展，鑒定了MYC等關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-11]。已有研究結(jié)果表明，乳管細胞中的天然橡膠生物合成主要受茉莉酸信號途徑調(diào)節(jié)（本實驗室尚未發(fā)表資料）。本研究從次生乳管分化和橡膠合成關(guān)鍵因子基因表達2個層面對無性系株間產(chǎn)膠能力的一致性進行分析，旨在為橡膠樹無性系產(chǎn)量性狀早期選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取定植3 a、徑圍一致的無性系熱研7-33-97、熱研8-79各5株，于樹高40、100 cm處的樹干上分別采集樹皮制備石蠟切片。開割口收集膠乳，冰上保存。

于儋州國營農(nóng)場大石村二隊選取8 a割齡、長勢良好的無性系熱研7-33-97、熱研8-79各5株，分別收集膠乳和采集割口附近的樹皮。

1.2 方法

1.2.1 顯微制片觀察 參照史自強等[12]的方法。樹皮標本分割后用80%（V/V）的酒精固定24 h，梯度酒精脫水，碘-溴染色后石蠟包埋，制備石蠟切片。切片機為Leica RM2235，切片厚度為15 μm。德國Leica DMLB型顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 熒光定量PCR 分別對3 a幼樹和8 a割齡膠樹膠乳中的MYC1、HRT2基因的表達情況進行分析，材料處理如下：（1）選取莖圍一致的熱研7-33-97、熱研8-79 3 a樹各5株，開割線后，采用3 d一刀的割制，分別收集第一刀、第二刀的膠乳并提取RNA。 （2）選取割齡8 a、長勢一致的熱研7-33-97、熱研8-79各5株，采用常規(guī)割制割膠，收集膠乳并提取RNA。

對膠乳中HblMYC1（GenBank： HM590649.1）、HRT2（GenBank： AB064661）[13]的表達情況進行熒光定量分析。定量分析基因引物參照趙悅[14]的博士論文，用于定量分析的內(nèi)參基因為yls8[15]，所用的引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳管分化能力株間一致性分析

對熱研8-79和熱研7-33-97乳管分化情況進行分析，結(jié)果表明，在3 a幼樹中，最內(nèi)層石細胞群以內(nèi)的次生乳管列數(shù)（a）在不同品系之間存在差異，并且同一植株在樹干的不同部位次生乳管列數(shù)也存在差異。通常樹高100 cm處次生乳管列數(shù)略少，而樹高40 cm處次生乳管列數(shù)有所增多（圖1-A、B、E、D）。在割齡8 a的大樹中，熱研8-79和熱研7-33-97在割線部位的最內(nèi)層石細胞以內(nèi)次生乳管列數(shù)存在顯著差異（p<0.05），熱研8-79顯著增多（圖1-C、F）。對同一品系、同一樹齡不同植株間的乳管列數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)株間有明顯差異?？梢?，次生乳管列數(shù)雖然能反應品系特征，但在同一品系內(nèi)株間及植株的不同部位一致性較差，未能很好的反映次生乳管分化的能力。

為了更直觀的顯示樹皮a的株間差異，在此對a值的變異系數(shù)進行了分析。由圖2可知，無性系熱研7-33-97 3 a幼樹中a值的株間變異系數(shù)較大，同一植株不同部位的差距也較明顯，其中樹高40 cm處比樹高100 cm處明顯偏低。在割膠大樹中株間a值的變異系數(shù)顯著增大，約為3 a幼樹的2倍。在熱研8-79中，3 a幼樹中a值的變異系數(shù)較小，約為10%，不同樹高之間差異不明顯；但割膠大樹中a值的變異系數(shù)大，高約35%。由此可見，割膠大樹中乳管列數(shù)株間差異極大，該參數(shù)不適合作為產(chǎn)量育種早期篩選的標記。與大樹相比，3 a幼樹中乳管列數(shù)的株間差異減小，但變異系數(shù)還是接近10%，因此尋找一個能充分體現(xiàn)乳管分化能力而且株間一致性更好的指標尤為必要。

為了消除樹皮厚度等因素給統(tǒng)計a帶來的差異，a值與該部分次生韌皮部厚度（b，單位mm）的比值（a/b）被引入到統(tǒng)計中。無性系熱研7-33-97 3 a幼樹在樹高40、100 cm處的a/b值相近，并且較低，大約為5；但在割膠大樹中a/b值出現(xiàn)了明顯的增加，大約為9。SAS分析結(jié)果表明，二者之間有顯著差異（p<0.05）。熱研8-79 3 a幼樹樹皮中a/b值較高，至少為8，不同樹高該值的差異不明顯，并且與割膠大樹的值差距小，3個部位之間無顯著差異（p>0.05）（圖3）。對2個品系進行比較分析，結(jié)果表明，熱研8-79在幼齡的階段就有很好的乳管分化能力，充分體現(xiàn)了該品系的早熟特征。

進一步分析a/b值的株間變異系數(shù)。由圖4可知，對于無性系熱研7-33-97，3 a幼樹樹高40 cm處株間a/b值的變異系數(shù)最低，約為6%；樹高100 cm處及割膠大樹該系數(shù)都增大，但不超過14%。無性系熱研8-79中，3 a幼樹樹高40 cm處a/b值的變異系數(shù)最低，僅為4%左右，而樹高100 cm處及割膠大樹該系數(shù)約為10%。

由以上結(jié)果可知， 在同樣的材料中a/b值的變異系數(shù)都低于a值的變異系數(shù)，a/b值能更好的消除株間差異，體現(xiàn)品系內(nèi)的一致性。與大樹相比，3 a幼樹樹高40 cm處樹皮中的a/b值不僅能充分體現(xiàn)品系的乳管分化特征和能力，而且具有更好的株間一致性，因此認為該值可作為產(chǎn)量育種早期篩選的標記之一。

2.2 基因表達一致性分析

對MYC1、HRT2基因的表達量進行分析，結(jié)果表明，熱研7-33-97 3 a幼樹割膠后，膠乳中的MYC1、HRT2基因表達量均明顯上調(diào)；在割膠大樹中，膠乳MYC1基因表達量進一步加大，但膠乳HRT2基因表達量明顯低于3 a幼樹。在熱研8-79中，膠乳MYC1基因表達量在3 a幼樹中受割膠上調(diào)，割膠大樹中表達量比3 a幼樹更高；而膠乳HRT2基因的表達量在3 a幼樹、割膠大樹中差異不明顯，且都維持高表達（圖5）。

對無性系熱研7-33-97和熱研8-79進行比較可知，無論在 3 a幼樹中還是割膠大樹中，熱研8-79膠乳MYC1、HRT2基因的表達量普遍高于熱研7-33-97，尤其是在割膠大樹中，HRT2基因的表達量二者差異達到顯著水平（p<0.05）。由此可見，膠乳MYC1、HRT2基因的表達量具有品系特征（圖5）。

為了進一步分析膠乳中MYC1、HRT2基因表達量在產(chǎn)量育種中應用的潛力，對其品系內(nèi)的株間一致性進行了分析。在熱研7-33-97中，MYC1、HRT2基因的表達量的變異系數(shù)在3 a幼樹第一刀時皆高達40%，可見一致性很差；第二刀的變異系數(shù)較第一刀明顯降低，但也有10%以上。大樹中MYC1變異系數(shù)約為20%，但HRT2的變異系數(shù)接近50%。熱研8-79中2個基因表達量變異系數(shù)在3 a幼樹割膠第一刀時差異較大，MYC1約為45%，而HRT2的變異系數(shù)約為20%；第二次割膠后，MYC1基因表達量變異系數(shù)降低至30%，HRT2的變異系數(shù)變化不大。割膠大樹中2個基因表達量變異系數(shù)都高達40%以上?？梢?，膠乳MYC1、HRT2基因的表達量在品系內(nèi)株間的一致性差（圖6），因此2個基因均不適合作為產(chǎn)量育種早期篩選的標記。

3 討論與結(jié)論

從橡膠樹產(chǎn)量育種中尋找與產(chǎn)膠能力密切相關(guān)的指標尤為重要，目前人們主要是從膠乳生理參數(shù)和產(chǎn)排膠特性等方面進行分析[17-19]，其結(jié)果對于篩選新的高產(chǎn)品系具有一定的作用。但由于這些生理參數(shù)通常是綜合性的指標，很難直接篩選出可供直接利用的種質(zhì)材料[20]。另外，種質(zhì)內(nèi)株間差異大也導致需要大規(guī)模和長時間的品種篩選，因此，尋找與具體性狀相關(guān)的并且株間一致性好的標記對于縮短育種周期具有重要的意義。本研究主要以樹皮中乳管分化的能力和橡膠生物合成關(guān)鍵基因的表達為研究對象，從這2個層面對品系內(nèi)株間產(chǎn)膠能力一致性進行了分析。

在無性系熱研7-33-97和熱研8-79中，不同樹齡、不同部位樹干樹皮a值和a/b值都具有品系特征，盧世香等[2]對這些參數(shù)與產(chǎn)量之間的關(guān)系也進行了初步研究，但對參數(shù)的株間一致性分析欠缺。本研究結(jié)果表明，品系內(nèi)株間樹皮a值的變異系數(shù)大，說明該值的株間一致性較差，不適合作為產(chǎn)量育種早期選擇標記。a/b值不僅能充分體現(xiàn)品系乳管分化能力和特征，而且能減少由于不同植株的樹皮厚度不同造成的乳管列數(shù)統(tǒng)計差異大的現(xiàn)象，材料中a/b值的變異系數(shù)比a值的變異系數(shù)明顯降低，可見該值具有更好的株間一致性。因此，a/b更適合作為產(chǎn)量育種早期選擇的標記。不同的樹齡及樹干不同的高度對a/b值也存在影響，3 a幼樹樹高40 cm處該值穩(wěn)定，株間一致性好，所以可作為產(chǎn)量育種早期篩選指標之一。

膠乳中一些特異表達的基因和橡膠產(chǎn)量相關(guān)[21]，但這些基因表達量在品系內(nèi)株間的一致性如何并不是很清楚。根據(jù)茉莉酸信號途徑和橡膠生物合成途徑[22-23]，筆者篩選出MYC1、HRT2基因進行分析，結(jié)果表明，膠乳中MYC1、HRT2基因表達量受割膠調(diào)控，且熱研7-33-97膠乳中MYC1、HRT2基因的表達量都低于熱研8-79，可見這些基因具有一定的品系特征。對這些基因在不同植株中表達量的變異系數(shù)進行分析，結(jié)果表明MYC1、HRT2基因表達量的株間一致性差，可能不適合作為產(chǎn)量育種早期選擇的分子標記，在育種中只能起到輔助作用。發(fā)展分子標記是育種的方向，尋找產(chǎn)量密切相關(guān)并且株間一致性好的特異基因?qū)τ诋a(chǎn)量育種的早期篩選很有必要，這些工作都有待進一步的研究。

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