吳麗敏 安心

摘 要：番茄是農業(yè)生產中的主要蔬菜品種之一。20世紀80年代以來，隨著保護地番茄種植面積的擴大，番茄莖基腐病的發(fā)生有加重趨勢，影響保護地番茄種植業(yè)的持續(xù)發(fā)展。本文通過對番茄莖基腐病病害致病菌的分離鑒定，為以后了解研究該致病菌的更詳盡的特性及病害的防治奠定基礎。通過柯赫氏法則可以證明番茄莖基腐病的致病菌為茄絲核菌。

關鍵詞：番茄莖基腐，病原菌，茄絲核菌

近年來，隨著遼寧省保護地番茄種植面積的增加，同時由于保護地集約化，濕度大、輪作等特定的栽培條件，導致番茄莖基腐病有逐年加重趨勢，嚴重影響番茄的產量和品質。如若疏于防治，番茄莖基腐病將會成為影響遼寧保護地番茄生產的重要病害之一。番茄莖基腐病在幼苗期及成株期均可產生危害，但主要危害即將定植的大苗和定植后番茄的莖基部或地下部位、側根。通過使用柯赫氏法則的四步來證明鑒定出番茄莖基腐病致病菌，了解熟悉其特性，來進行更好的防治。

1 病害的檢視

將采集來的病害標本用刀片輕輕刮取病害部位的菌絲體，置于滴有浮載劑的載玻片上，加蓋玻片在顯微鏡下檢視，觀察到立枯絲核菌，初步認定為其為番茄莖基腐病的致病菌。

2 病菌的分離純化

2.1 常規(guī)組織分離

取番茄莖基部感病組織，用無菌水將病部表面清洗干凈，然后從病健交界處切取0.5cm×0.5cm的病組織，在75%酒精中浸1～3s后，再在0.1%升汞溶液中處理30s，而后用滅菌水換洗3次，將其移置PDA平板上25℃培養(yǎng)。待PDA平板上分離的病菌生長出菌落后，切取菌落前緣的菌絲移入PDA斜面上25℃恒溫培養(yǎng)，獲得病菌純培養(yǎng)。

2.2 病原菌觀察

采取病原菌直接挑取法，在光學顯微鏡下直接檢視，進行病原菌形態(tài)描述。

人工培養(yǎng)條件下，約15天左右，菌絲彼此交織糾集形成褐色或黑褐色的菌核，球形、長粒狀或不規(guī)則形，大小2.3mm×1.5mm；菌核表面粗糙，內外層顏色較一致，結構疏松。菌絲初期無色，老熟后漸為褐色，平均直徑為9.6μm；菌絲分支多呈直角，近分支處形成隔膜，分支基部呈縊縮狀，染色結果表明該菌菌絲細胞為多核。

由病原菌在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落觀察，前期生長呈無色纖細菌絲群，后逐漸變成褐色，并形成菌核。病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長較快，3天菌落直徑可達80μm，菌落初期無色，后逐漸變成褐色；菌落平整，無氣生菌絲，邊緣長滿菌絲；后期可形成比較繁茂的氣生菌絲；約經15天后，菌絲逐漸糾結形成褐色菌核。

3 病害接種

將分離純化后的病原菌接種于番茄植株上，保濕培養(yǎng)，觀察植株受害癥狀。

番茄莖基部經室內接種，25℃保濕培養(yǎng)6～8天后，莖基部開始產生淡褐色病斑，證明在25℃條件下，病原菌侵染葉片的潛育期一般為6～8天；由此也表明病原菌對寄主的致病力較強，侵染速度較快。此為病害防治適期的確定提供了一定理論依據(jù)。番茄莖基腐病病菌在相對濕度100%、溫度為25℃的條件下，4～5天可侵入寄主植物，6～8天表現(xiàn)癥狀。直接涂抹接種和針刺接種2種方法均可使番茄莖基部發(fā)病，說明該菌有直接侵染的能力，傷口對病原菌侵入更為有利。

番茄莖基腐病主要危害植株較大幼苗及定植后番茄植株的莖基部，有時可延及地下主、側根。發(fā)病部位初呈暗褐色，繼之環(huán)繞莖基部或根莖處擴展，引起皮層腐爛，影響水分和營養(yǎng)輸導；導致地上部葉片變黃。果實膨大后，嚴重發(fā)病植株因養(yǎng)分供不應求逐漸萎蔫枯死。發(fā)病后期植株病部表面常形成深褐色、大小不一的菌核；有時感病植株干腐的髓腔內可形成黑褐色、顆粒狀菌核。

經人工接種證病結果表明，番茄莖基部表現(xiàn)出相似的癥狀，接種5天后開始表現(xiàn)癥狀，初為暗黃色，后繞莖基或根莖擴展，最后呈腐爛狀態(tài)。

從發(fā)病部位經組織分離后再次獲得病原菌，經鏡檢形態(tài)特征鑒定，并與原接種體菌絲融合測定，結果與原接種體形成融合，確定為相同的病原菌，因此證實所分離的原接種菌株為番茄莖基腐病的致病菌。

4 病害再分離

采用常規(guī)組織分離法對發(fā)病組織進行病菌分離，培養(yǎng)后于顯微鏡下觀察，鑒定病原菌的分類歸屬。

經參考資料和鑒定，本試驗采集分離的番茄莖基腐病的病原菌最后確認為茄絲核菌（Rhizoctonia solani），其分類歸屬為真菌界，無性型真菌，絲孢綱，無孢目，絲核菌屬。

該菌在PDA、PSA、理查瓊脂培養(yǎng)基、番茄煎汁瓊脂培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、番茄燕麥瓊脂培養(yǎng)基、2%水瓊脂培養(yǎng)基上均能生長，最適培養(yǎng)基是燕麥片瓊脂培養(yǎng)基；理查培養(yǎng)基利于菌核形成，且產生菌核數(shù)量最多。

該菌在以PDA基礎培養(yǎng)基，將PDA中的葡萄糖換成蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、糊精制成的培養(yǎng)基上均能生長，在淀粉和糊精培養(yǎng)基上，菌絲生長速度顯著較快，以淀粉和麥芽糖制成的培養(yǎng)基產生菌核數(shù)量最多，菌核萌發(fā)，以麥芽糖最適宜；不同碳源對菌核萌發(fā)的影響差異顯著，以麥芽糖中菌核的萌發(fā)率最高，葡萄糖，蔗糖與甘露糖次之，而山梨糖的利用率最低。

該菌在氮源硝酸鉀、硝酸鈉、磷酸二氫銨、蛋白胨培養(yǎng)基上生長較快，最適為硝酸鈉，在氮源脲的條件下5天菌落未見擴展，從菌核產生數(shù)量來看，最適氮源為蛋白胨，而在硝酸鉀、磷酸二氫銨、氯化銨、脲、精氨酸培養(yǎng)基上，20天后均未產生菌核；不同氮源對菌核萌發(fā)的影響差異顯著，以蛋白胨中菌核的萌發(fā)率最高，硝酸鈉和硝酸鉀次之，而脲的利用率最低。

該菌在2～32℃溫度范圍內均可生長，適宜范圍為20～25℃，最適為20℃；考察菌核產生數(shù)量，以15℃產生量最多，5～30℃溫度范圍內菌核均能萌發(fā)，20℃最適菌核萌發(fā)。

該菌在pH值3～10的范圍內均可生長，最適宜菌絲生長的pH值5～7，在pH7條件下，菌核產生數(shù)量最多，pH6最適合菌核萌發(fā)。

無論是黑暗條件還是光照條件，在菌絲生長方面和菌核產生數(shù)量方面，均無明顯差異。

菌絲高致死溫度為51℃、10分鐘；菌核高致死溫度為60℃、10分鐘。

研究表明立枯絲核菌對不同碳、氮源的利用效率差異很大，說明該菌盡管是腐生性很強的菌，但是其營養(yǎng)利用的選擇性還是相當明顯的。該菌生長適溫在20～25℃之間，在一定程度上反應了該病遼寧地區(qū)發(fā)生的原因。

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