黃菁菁，馮美江

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學科，江蘇 南京 210011)

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隱丹參酮對老年大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究

黃菁菁，馮美江*

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學科，江蘇 南京 210011)

目的：探討隱丹參酮(cryptotanshinone，CTN)對老年大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。方法：Longa法制作大鼠中動脈缺血再灌注損傷模型。將SD大鼠隨機分為正常對照組(CTL)、缺血再灌注組(I/R)、隱丹參酮低劑量治療組(CTN1)(2.5mg/kg)和隱丹參酮高劑量治療組(CTN2)(5mg/kg)，對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，測定腦梗死體積，測定Caspase-3蛋白表達，檢測SOD活性、GSH-Px、MDA及NO的含量變化，實時熒光定量PCR法檢測腦組織中miR-210的表達。結果：與缺血再灌注組相比，隱丹參酮組可顯著降低大鼠神經(jīng)功能損傷評分、減少腦梗塞體積、顯著降低腦組織內氧自由基的生成，提高SOD活性，并降低miR-210的表達， miR-210的表達量由(12.29±2.14)降至(6.91±0.53)(P<0.05)。結論：隱丹參酮對老年大鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的保護作用，其機制可能部分與減輕氧化應激損傷、抗凋亡和降低miR-210的表達有關。

隱丹參酮；缺血再灌注；氧自由基；miR-210

缺血性中風約占全部中風的3/4，是中老年人致死、致殘的主要疾病之一，一半以上的存活者遺留偏癱、失語、智能減退等殘疾，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。所以提高缺血性中風治愈率、降低致殘率已成為當今醫(yī)學領域面臨的重要課題之一。

氧穩(wěn)態(tài)的維持是大腦正常工作的基礎，而腦缺血缺氧性損傷所產(chǎn)生的自由基會對神經(jīng)元細胞膜造成損傷[1]。自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。

microRNA(miRNA) 是由20～24個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也參與了生物機體氧穩(wěn)態(tài)的調節(jié)，其中研究較多的miR-210就是一種在缺氧狀態(tài)下，由缺氧誘導因子1α(hypoxia induced factor 1α，HIF-1α)誘導產(chǎn)生的miRNA[2]。缺血的成年大鼠腦皮質中miR-210表達明顯上調，通過激活Notch1信號通路，調節(jié)缺血后的血管再生[3]，而抑制miR-210表達可有效抑制缺氧誘導的血管形成與ephrin-A3的表達[4]。此外，外周血中的miR-210 有可能作為一個新的敏感的急性腦缺血臨床診斷與預后判斷的生物標記[5]。

隱丹參酮是從唇形科植物丹參根中提取分離出的二萜醌類有效單體。研究表明隱丹參酮對谷氨酸誘導的皮層神經(jīng)元凋亡具有保護作用[6]，但其對老年大鼠缺血再灌注損傷后的保護作用及對氧自由基和miR-210表達的影響尚未見報道。本研究采用栓塞大鼠大腦中動脈并再灌注模型，在2011年9月—2012年11月期間觀察隱丹參酮對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的保護作用，并對其可能作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

Sprague-Dawley(SD)大鼠購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心；隱丹參酮購自南京替斯艾么中藥研究所；氯化三苯基四氮唑(TTC)購自北京化學試劑公司；SOD、GSH-Px、MDA和NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；用于RNA提取的Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉錄試劑盒、用于熒光定量聚合酶鏈反應(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)的SYBR試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品；miR-210、U6的反轉錄和PCR引物由上海生工生物有限公司提供；Caspase-3和β-actin的抗體為美國cell Signaling公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組及模型制作

成年雄性SD大鼠48只，20月齡，體重300～400g，隨機分為正常對照組(CTL)、缺血再灌注組(I/R)、隱丹參酮低劑量組(CTN1)(2.5mg/kg)和隱丹參酮高劑量組(CTN2)(5mg/kg)，每組各12只。參照Longa法，制作大鼠缺血再灌注模型，缺血時間2h，再灌注72h。在缺血期間及再灌注后2h保持體溫在(37±0.5)℃。CTN組分別在術后60min、24h及48h，將不同劑量的隱丹參酮溶于生理鹽水中，行3次腹腔注射。根據(jù)以往相關研究，選取注射劑量分別為2.5mg/kg和5mg/kg[7]。CTL組和I/R組每次腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 神經(jīng)功能缺損評分

按照Zea Longa和Bederson的方法[8],對各組動物于蘇醒后6h內進行評分：0分：無神經(jīng)缺損癥狀；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右側旋轉；3分：向右側傾倒；4分：不能自己行走或昏迷。

1.4 腦梗死體積的測定

每組隨機選擇6只大鼠，斷頭取腦，棄去嗅球、小腦及低位腦干。置-20℃冰箱中冷凍20min，距額極3mm切片，每片厚2mm，放入1.0%TTC水溶液中，37℃孵育30min，隨即放入10.0%甲醛溶液避光保存24h，用計算機圖像解析程序, 分別將所有腦切片圖像掃描, 測定腦梗死區(qū)的體積。

1.5 Western blot 測定Caspase-3蛋白的表達

將梗死區(qū)組織研碎后加入裂解液勻漿，10 000r/min(4 ℃)離心10 min，分離上清液并使用BCA法測定蛋白總濃度后分裝，保存于-20℃。取30μg蛋白樣品100 ℃沸水加熱5 min，在10.0% SDS-PAGE膠上進行電泳。蛋白質經(jīng)電泳分離后，轉移到PVDF膜(Amersham, Piscataway, NJ,USA)上。轉移后取出印跡膜，漂洗后放入盛有用TBS配成的5.0%脫脂奶粉液內，放在搖床上封閉印跡膜1h，然后與Caspase-3抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶1 000)在4℃輕搖孵育過夜。漂洗后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)(美國Bio-Rad公司)在常溫下孵育30min，ECL法顯色。蛋白條帶使用Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech，San Leandro，CA，USA)進行分析，以β-actin作為內參。

1.6 SOD含量測定

組織稱重勻漿后，3 000×g離心15min，留取上清液。SOD的活性測定按照SOD測定試劑盒的使用說明進行。將500μL樣品加于酶標板孔底部，用封板膜封板后置 37℃溫育30min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外，溫育并洗滌。每孔加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，最后每孔加終止液50μL，終止反應。以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度。

1.7 GSH-Px含量測定

GSH-Px的活性測定按照GSH-Px測定試劑盒的使用步驟進行。依次加入檢測緩沖液、待測樣品和檢測工作液，混勻。加入4μL 15mmol/L過氧化物試劑溶液后，反應開始。25℃條件下，使用培養(yǎng)板振蕩器混勻。酶標儀測定A340，計算每毫克蛋白含GSH-Px的量。

1.8 MDA含量測定

MDA的含量測定按照試劑盒說明書進行操作。在離心管內加入0.1mL勻漿液、裂解液或PBS等適當溶液作為空白對照，加入0.1mL上述不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0.1mL樣品用于測定；隨后加入0.2mL MDA檢測工作液?；靹蚝螅?00℃加熱15min。水浴冷卻至室溫，1 000×g室溫下離心10min。取200μL上清加入到96孔板中，隨后用酶標儀在532nm測定吸光度，計算每毫克蛋白含MDA的量。

1.9 NO含量測定

NO的含量測定按照試劑盒說明書進行操作。取出Griess Reagent I和II，使回復室溫。用待測樣品所用溶液稀釋標準品，按50μL/孔，在96孔板中加入標準品及樣品；分別在各孔中加入室溫Griess Reagent I和Griess Reagent II，在550 nm 測定吸光度。按公式計算可得每毫克蛋白含NO的量。

1.10 總RNA提取

按Trizol 試劑說明書抽提樣品總RNA。DEPC 處理水溶解RNA，分光光度計測定260nm 及280nm處吸光度值，確定RNA溶液濃度和純度。取2～5μg總RNA，以1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA 的完整性。

1.11 逆轉錄反應和熒光定量PCR

用AMV逆轉錄酶(中國大連TaKaRa公司)和與其互補的反義引物逆轉錄成cDNA。再取2μg cDNA加入20μL Real-time PCR體系，擴增條件為：95℃預變性15min；95℃ 15s，60℃ 1min，測定熒光強度，重復40個循環(huán)；72℃延伸7min。使用U6為實驗內參。miR-210 上游: 5’-ACACTCCAGCTGGGCUGUGCGUGUGACAGC-3’,下游:5’-CTC AACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGC CGC-3’；U6 上游: 5’-CTCGCTTCGGCA GCACA-3’,下游: 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3’。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死體積

與I/R組比較， CTN2組隱丹參酮可以明顯降低實驗大鼠的神經(jīng)功能缺損評分(P<0.05)，而CTN1組改善不明顯。CTL組未見梗死。與I/R組比較，CTN1、CTN2均可減小實驗大鼠的腦梗死體積 (P<0.05)。見表1。

表1 四組大鼠行為學評分及腦梗死體積測定 (±s)

注：與CTL組比較，aP<0.05。

2.2 Caspase-3蛋白表達

使用western blot測定腦組織中caspase-3的含量。結果顯示，腦組織缺血再灌注后caspase-3的含量顯著增加，而隱丹參酮可以明顯減少實驗大鼠腦中caspase-3的表達(P<0.05)，其中CTN2組比CTN1組更加顯著減少了caspase-3表達(P<0.05)。

2.3 SOD活性、GSH-Px、MDA及NO含量

SOD具有抗氧化應激損傷作用，而GSH-Px是防止氧化性損傷的一種重要酶。缺血再灌注后與對照組相比，SOD的活性及GSH-Px含量明顯降低，但使用隱丹參酮后，兩者含量均有上升。在缺血再灌注過程中，抗氧化酶的減少會導致自由基產(chǎn)物的增加，從而可能對神經(jīng)元細胞造成損傷。在缺血再灌注損傷時MDA和NO的含量明顯升高，而使用隱丹參酮后，MDA和NO的含量有所下降，更進一步證明隱丹參酮可以抑制或者減少自由基的生成。

圖1 四組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白的表達

表2 四組大鼠腦組織SOD、GSH-Px、MDA、NO的含量 (±s)

2.4 miR-210的表達

CTL組、I/R組、CTN1和CTN2組中miR-210的表達水平分別為：5.51±0.41、12.29±2.14、9.13±1.16、6.91±0.53。與CTL組相比，I/R組miR-210的表達顯著升高(P<0.05)，CTN組則無明顯差異(P>0.05)。CTN組相比I/R組，miR-210的含量顯著降低(P<0.05)，且高劑量組相較與低劑量組更有效，說明隱丹參酮參與了對miR-210表達的調節(jié)。

圖2 miR-210的表達

3 討論

缺血性中風又稱腦梗死，多是在動脈粥樣硬化基礎上，由各種原因引起腦動脈血流量減少或中斷，導致局部腦組織缺血、缺氧，從而引起相應神經(jīng)功能受損[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學證實，腦梗死發(fā)病機制極其復雜，其治療也尚未有重大突破，延長腦細胞缺氧耐受時間、改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)成為治療關鍵，而中醫(yī)藥在此方面具有獨特優(yōu)勢。

隱丹參酮是從唇形科植物丹參根中提取分離得到的一種中藥單體，具有抗氧化和抗衰老功能。研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可影響缺血再灌注后Bax和Bcl-2等相關凋亡基因的表達，對治療冠心病、心絞痛和心肌損害具有一定療效[9]。隱丹參酮還可抑制谷氨酸誘導的皮層神經(jīng)元凋亡[10]。本研究表明，隱丹參酮可以顯著降低缺血再灌注后老年大鼠的神經(jīng)功能缺損行為學評分，降低大鼠腦梗死體積，顯著減輕了缺血再灌注對大鼠腦組織的損傷，證明隱丹參酮具有一定的腦保護作用。

Caspase家族是一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶。在缺血性損傷中，Caspase-3的活化可以導致DNA的斷裂和神經(jīng)元的凋亡[11]。目前認為，Caspase-3是凋亡過程中最主要的蛋白酶，是細胞凋亡蛋白酶反應的必經(jīng)之路[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可顯著減少腦缺血再灌注所誘導的Caspase-3表達上調，說明隱丹參酮具有一定的抗凋亡作用。

自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物， ROS和NO是其中主要的自由基。在通常情況下，腦組織受到抗氧化酶(如SOD和GSH-Px)和抗氧化物質(如維生素C、維生素E和巰基蛋白)的保護，可以及時清除有害自由基[13]。但在缺血缺氧的情況下，自由基的產(chǎn)生會急劇增加，當所增加的自由基超過機體的清除能力時就會導致氧化應激損傷。多聚不飽和脂肪酸是對ROS最敏感的化合物，其降解會導致MDA的增加，而后者又可以破壞細胞膜基質的流動性，從而破壞細胞膜表面蛋白的結構與功能，甚至可影響某些基因的表達。與之相應的是，NO的增加會導致線粒體中細胞色素c的釋放，激活細胞的凋亡信號通路，導致細胞死亡[14]。我們的實驗結果表明，在缺血再灌注過程中，SOD活性的大幅度降低伴隨著MDA和NO含量的迅速增加；而隱丹參酮則可部分逆轉這一過程。

在缺氧狀態(tài)下，miR-210 依賴于缺氧誘導因子1α( hypoxia induced factor 1α，HIF-1α)而誘導產(chǎn)生[15]。研究表明，在大鼠的缺血腦組織中，miR-210與Ephrin-A3 (EA3)和Neuronal Pentraxin 1 ( NPX1) 的mRNAs的3’非翻譯區(qū)連接，增強 EA3 和NPX1蛋白的表達，調控腦缺血后血管的新生過程[16]。此外，抑制miR-210的表達可減少細胞中超氧化物的產(chǎn)生，而缺氧時生成的超氧化物也是造成神經(jīng)損傷的一個重要來源[17-18]。我們研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可顯著降低腦缺血再灌注損傷所誘導的miR-210表達上調。

本研究選取了2.5mg/kg及5mg/kg兩個不同劑量的隱丹參酮進行療效研究，研究發(fā)現(xiàn)，除了神經(jīng)功能缺損行為學評分低劑量組無統(tǒng)計學意義外，其它各項指標差異均有統(tǒng)計學意義，且高劑量組療效更佳。故考慮神經(jīng)功能缺損行為學評分在低劑量組無意義可能與樣本數(shù)量較小，存在一定的實驗誤差有關。當然，由于實驗經(jīng)費等限制，未設陽性對照藥，但從近些年來其它隱丹參酮相關文獻獲知， 5mg/kg的隱丹參酮在腦缺血再灌注損傷中有一定療效，亦可佐證其藥物治療的可行性。

總之，我們的研究結果表明，隱丹參酮對老年大鼠的缺血再灌注損傷可發(fā)揮確切的神經(jīng)保護作用，其機制可能部分與其抗氧化應激、抗凋亡及降低miR-210的表達上調有關。但隱丹參酮對缺血再灌注后miR-210的具體調節(jié)機制及效應仍有待今后進一步研究。

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(責任編輯：宋勇剛)

Protective Effects and Possible Mechanism of Cryptotanshinone in Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Aged Rats

Huang Jingjing，F(xiàn)eng meijiang*

(Department of Geriatrics, The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Jiangsu 210011，China)

Objective:To explore the protective effects and possible mechanism of cryptotanshinone in cerebral ischemia-reperfusuion injury in aged rats.Methods:A model of rat cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury based on Longa method was made. The Sprague-Dawley(SD)rats were randomLy divided into normal control group(CTL), I/R group, cryptotanshinone Low-dose(CTN1) treatment group (2.5mg/kg) and cryptotanshinone High-dose(CTN2)treatment group (5mg/kg). Neurological deficit score was evaluated when rats were allowed to awaken at 6h after operation in each group. Cerebral infarct volume was also determined. Western blot was used to detect the expression of Caspase-3 protein level. The activity of SOD and the concentration of GSH-Px, MDA and NO in brain tissues were performed. The expression of miR-210 was detected by real-time PCR. Results:Compared with the I/R group, CTN group significantly reduced the neurological deficit scores and infarct volumes. The decrease of oxygen free radical production and the increase of SOD activity in the brain tissues were also observed. Real-time PCR showed that the expression of miR-210 was significantly reduced after cryptotanshinone treatment. CTN2 group ’s expression of miR-210 reduced from (12.29±2.14) to (6.91±0.53)(P<0.05). Conclusion:Results indicated that cryptotanshinone could protect against cerebral I/R injury in aged rats, which may partly attribute to alleviating the oxidative stress injury，anti-apoptosis and the reduction of miR-210 expression.

Cryptotanshinone; Ischemia-reperfusion Injury; Oxygen Free Radicals; miR-210

2014-08-02

江蘇省自然科學基金資助項目(BK2008480)

黃菁菁(1983-)，女，碩士，南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向為老年醫(yī)學。

馮美江(1968-)，男，南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院主任醫(yī)師，研究方向為老年醫(yī)學。Email: mjfeng416@aliyun.com。

R285

A

1673-2197(2014)23-0004-04