杜曉華,黃伶俐,劉會(huì)超

（河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

植物熱激蛋白70（HSP70）研究進(jìn)展

杜曉華,黃伶俐,劉會(huì)超

（河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

熱激蛋白是生物體遭受脅迫時(shí)的一類(lèi)保護(hù)性蛋白,HSP70家族作為抗脅迫的主要分子伴侶之一,目前研究的最為深入.綜述了植物HSP70的類(lèi)型與分布、結(jié)構(gòu)、功能及其編碼基因的特征與表達(dá)調(diào)控等方面的研究進(jìn)展,為提高植物的耐受性、植物病蟲(chóng)害的防治和植物轉(zhuǎn)基因等方面提供一定的基礎(chǔ)知識(shí).

HSP70；分布；結(jié)構(gòu)；功能

在自然或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件下,植物不斷遭受著環(huán)境脅迫.某些環(huán)境因子,如大氣溫度,僅需幾分鐘對(duì)植物的生存可能就成為一種脅迫.近年來(lái),極端高溫天氣和持續(xù)高溫狀況的不斷出現(xiàn),給植物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物的生產(chǎn)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn).熱激蛋白（heat shock protein,HSP）的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑給植物抗熱性研究帶來(lái)了一縷曙光.HSP最初是Tissieres于1974年利用SDS-PAGE法分離得到[1].后來(lái)研究證實(shí),一切生物細(xì)胞（包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞）在受到高溫誘導(dǎo)時(shí),都可以合成一類(lèi)具有生物學(xué)活性和相似功能的蛋白質(zhì)[2].如果溫度突然升高5～10℃,植物會(huì)產(chǎn)生HSP防御熱脅迫.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HSP種類(lèi)眾多,相對(duì)分子質(zhì)量從15～104 kDa不等.依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小,可分為HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和smHSP（小熱激蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量15～30 kDa）5個(gè)家族,分別定位于細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)中[3].其中,作為分子伴侶的HSP70在大多數(shù)生物中含量最多,在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)后表達(dá)最顯著,是目前研究最多也最為深入的熱激蛋白.本文現(xiàn)就植物HSP70方面的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)行綜述,以期為其他熱激蛋白以及植物抗熱性研究提供借鑒.

1 HSP70的類(lèi)型及其分布

HSP70家族作為分子伴侶,是迄今為止已知的最保守的蛋白家族之一[4],它有4種存在形式：第一種為結(jié)構(gòu)型蛋白HSP73,主要參與細(xì)胞功能；第二種為誘導(dǎo)型蛋白HSP72,抵抗外界環(huán)境脅迫；第三種為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78和GRP75,分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和線粒體內(nèi)[5]；第四種是參與光合系統(tǒng)Ⅱ的HSP70B[6].在高等植物葉綠體中,多種HSP70同源蛋白分布在葉綠體膜和葉綠體基質(zhì)中[7-8].煙草是目前所知唯一具有核HSP70的植物[9].

2 HSP70的結(jié)構(gòu)

HSP70蛋白是高度保守的具備ATPase活性的分子伴侶,其結(jié)構(gòu)包括2個(gè)主要功能區(qū)[10-11]：N端ATPase區(qū)和C端多肽結(jié)合區(qū)（如圖1）.N端45 kDa左右的核苷酸結(jié)合區(qū)（nucleotide binding domain, NBD）,氨基酸序列高度保守,具有結(jié)合并水解ATP的活性；C端多肽結(jié)合區(qū)25 kDa左右,連同C末端亞區(qū)合為底物結(jié)合區(qū)（peptide binding domain,PBD）,通過(guò)一絞合鏈部分與N端ATPase區(qū)連接[12-13].

NBD區(qū)包括2個(gè)相似的球形結(jié)構(gòu)（LobeⅠ和LobeⅡ）,ATP結(jié)合位點(diǎn)位于兩球形結(jié)構(gòu)所形成的深溝基部.LobeⅠ和LobeⅡ被進(jìn)一步劃分為L(zhǎng)obe IA、Lobe IB、Lobe IIA、Lobe IIB 4個(gè)部分.PBD區(qū)包括由2個(gè)β折疊組合、4個(gè)Loop環(huán)組成的“口袋”及由3個(gè)α-螺旋組成的“蓋子”結(jié)構(gòu).當(dāng)ATP結(jié)合到HSP70時(shí)引起ATPase區(qū)構(gòu)象發(fā)生改變并引起PBD區(qū)變化,“蓋子”打開(kāi),多肽結(jié)合進(jìn)去；當(dāng)ATP水解為ADP時(shí), PBD區(qū)影響因素改變,“蓋子”重新關(guān)閉,從而“捕捉”住結(jié)合的多肽,使HSP70與多肽長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合[12].NBD和PBD通過(guò)一個(gè)保守的Linker結(jié)構(gòu)連接,并在NBD-PBD的信息傳遞中起到重要作用：當(dāng)NBD結(jié)合ATP時(shí),NBD和PBD相互靠近,Linker淹埋在NBD和PBD的接觸面中；在NBD結(jié)合ADP時(shí),Linker呈柔性的舒展?fàn)顟B(tài),暴露在NBD和PBD的外面[14-19].

圖1 HSP70結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structural diagram of HSP70

3 HSP70的功能

HSP70作為分子伴侶復(fù)合物的組成成分,分布于不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中并發(fā)揮著多種功能,如蛋白折疊、裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜運(yùn)輸、蛋白作用調(diào)控、蛋白降解調(diào)控和蛋白不可逆聚合調(diào)控等[20-21].HSP70除了正常生理功能外,最重要的功能是細(xì)胞保護(hù)和對(duì)脅迫環(huán)境的一定適應(yīng)性[22-23].

3.1 分子伴侶功能

HSP70以ATP依賴的方式起作用,許多蛋白的折疊需要由HSP70和HSP60這樣的分子伴侶來(lái)協(xié)助將其正確折疊和成功組裝轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞈B(tài)或自然態(tài).HSP70以ATP依賴的方式在肽鏈折疊所需的所有片段集齊之前維持新合成的多肽的穩(wěn)定性,再通過(guò)有控制地釋放幫助其折疊.此外,自然狀態(tài)的蛋白會(huì)因?yàn)椴祭蔬\(yùn)動(dòng)而導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊,這種現(xiàn)象在植物遭到外界脅迫條件下更加普遍.HSP70能阻止變性蛋白聚集并幫助變性蛋白恢復(fù)成自然狀態(tài)[24].

3.2 進(jìn)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能

對(duì)擬南芥HSP70的突變體cpHSC70-1和cpHSP70-2的研究發(fā)現(xiàn),在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)葉綠體的過(guò)程中,HSP70參與了蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的早期階段[25].在苔蘚葉綠體蛋白編碼中,有4種HSP70基因起作用,破壞其中任意一個(gè)HSP70基因,都可能使葉綠體受損.向突變體HSP70-2的葉綠體中轉(zhuǎn)入蛋白,蛋白不能正常折疊,葉綠體表現(xiàn)出明顯的損傷[26].

3.3 SP70在非生物脅迫中的作用

植物的光合作用對(duì)高溫特別敏感,常先于呼吸作用受到抑制.植物中核酮糖-1,5二磷酸羧化酶、NADP-甘油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸烯醇丙酮酸化酶在高溫下穩(wěn)定性較差[3].長(zhǎng)時(shí)間光抑制會(huì)對(duì)光系統(tǒng)造成損傷,被損傷的主要對(duì)象是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心的D1蛋白.而葉綠體中HSP70蛋白對(duì)光抑制有防御作用,對(duì)PSⅡ有保護(hù)和修復(fù)作用.HSP70B蛋白大量表達(dá)能降低光對(duì)光合系統(tǒng)Ⅱ的抑制作用并且有修復(fù)作用；相反,HSP70B低表達(dá)光抑制效果就會(huì)增強(qiáng)[27].熱脅迫造成了植物組織的氧化傷害,這種傷害可能因?yàn)榛钚匝醍a(chǎn)生所致,而HSPs的高效表達(dá)可減輕傷害,提高植物的抗熱性.

一些HSP70并不只在高溫脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生,它們還能被很多不同的環(huán)境脅迫和條件所誘導(dǎo),其中包括水分虧缺、低溫、鹽和傷害等.蘆薈在缺水條件下,可溶性糖、脯氨酸和果聚糖合成增加,以此來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓,在這一抗脅迫過(guò)程中HSP70調(diào)節(jié)其參與合成可溶性糖等反應(yīng)系統(tǒng)的酶的活性,泛素對(duì)蛋白進(jìn)行選擇性降解.地衣在鎘濃度允許范圍,HSP70蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大,且隨后隨著濃度的升高蛋白表達(dá)量不變.由于鎘對(duì)巰基的親和力強(qiáng),高濃度的鎘會(huì)毒害蛋白,擾亂細(xì)胞新陳代謝,從而使整個(gè)植物體中毒[28].在研究蒽和殺草敏對(duì)浮萍的影響過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：在自然界廣泛存在的蒽是一種光敏性強(qiáng)的物質(zhì),很容易在植物中發(fā)生反應(yīng)形成不感光物質(zhì)（多為醌類(lèi)物質(zhì)）,阻斷光合作用中的感光過(guò)程；殺草敏是一種有機(jī)氯化合物,易與光合系統(tǒng)II中的蛋白結(jié)合,抑制光合作用[29].最初的脅迫信號(hào)觸發(fā)抗脅迫機(jī)制中下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控,普通蛋白合成終止,HSPs合成增加,尤其是起主要作用的HSP70合成快速增加,幫助恢復(fù)體內(nèi)平衡,保護(hù)和修復(fù)受損傷的膜和蛋白[30].脅迫超過(guò)一定程度,HSP70蛋白便因相關(guān)酶系統(tǒng)抑制而不再增加表達(dá)量,減弱甚至失去保護(hù)作用[28].

3.4 SP70在生物脅迫中的作用

生物脅迫因素主要為病蟲(chóng)害脅迫.小鼠皮下注射提純的植物HSP70后進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)有很高的HSP70效價(jià),說(shuō)明HSP70在免疫過(guò)程中可以高效引發(fā)信號(hào)蛋白.植物HSP70與動(dòng)物HSP70在結(jié)構(gòu)和功能上的一系列機(jī)制有著很高的相似性[31].從南瓜滲透液和胞間連絲中分離到幾種HSP70同源蛋白,參與協(xié)助濾過(guò)性病毒枯葉病毒的胞間轉(zhuǎn)運(yùn)[32].在病害中HSP70水平提高有助于阻止中毒蛋白聚集.

4 HSP70基因及其表達(dá)調(diào)控

HSP70家族基因結(jié)構(gòu)高度保守,大鼠與人的HSP70氨基酸序列同源性為95%[33].HSP70基因一般5'端有100 bp左右的非翻譯區(qū),3'端有200 bp的非翻譯區(qū),中間的開(kāi)放閱讀框（open-reading frame,ORF）包含大約2 000 bp堿基用于編碼HSP70蛋白[33-35].植物的ORF框分為2類(lèi),一類(lèi)含有內(nèi)含子,如玉米、牽?；ǖ鹊腛RF框；而另一類(lèi)則無(wú)內(nèi)含子,如大豆、胡蘿卜等的ORF框[36].在HSP70基因的ORF上游通常存在基因調(diào)控區(qū),包含多個(gè)熱激元件（heat hock elements,HSE）,還有一些類(lèi)似HSE的元件,如TATA盒和CCAAT盒等,其功能是與熱激因子（heat shock factor,HSF）結(jié)合調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻谋磉_(dá)[37].HSP70基因家族中,不同基因上的HSE在數(shù)量和種類(lèi)上存在差異,HSE的多樣性使編碼的HSP70產(chǎn)物產(chǎn)生差異[38].

HSP70基因的表達(dá)有一系列反饋機(jī)制.未受到熱脅迫時(shí),HSF通常存在于細(xì)胞質(zhì)中,以單體形式與HSP70結(jié)合,此時(shí)HSF不能結(jié)合到DNA上指導(dǎo)翻譯.脅迫誘使HSF單體結(jié)合成三聚體,使其與HSE的親和力提高了1 000倍,HSF三聚體一旦結(jié)合到HSE上,三聚體HSF被磷酸化,并啟動(dòng)HSP基因表達(dá)[39].隨后,HSP70與HSF結(jié)合,導(dǎo)致HSF/HSE復(fù)合物的分離,并且HSF被回收成單體形式.當(dāng)HSP70積累至與HSF足夠結(jié)合時(shí),HSP mRNA的轉(zhuǎn)錄終止.細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白和HSF之間對(duì)HSP70的競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控了整個(gè)基因表達(dá)過(guò)程.

5 展望

熱激蛋白HSP70作為最主要的分子伴侶之一,在新蛋白合成后的折疊與組裝、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、提高植物抵御逆境脅迫、增強(qiáng)植物適應(yīng)性方面有著重要作用.目前,有關(guān)植物HSP70蛋白的類(lèi)型、分布、結(jié)構(gòu)和功能方面的研究已經(jīng)不少,一些問(wèn)題已經(jīng)開(kāi)始變得明朗,不同植物中HSP70基因的克隆正在如火如荼地進(jìn)行,有關(guān)HSP70基因的表達(dá)調(diào)控也已起步.當(dāng)前及今后一段時(shí)間,由于基因克隆技術(shù)操作的日益完善和便捷,關(guān)于HSP70及其他HSP的研究可能會(huì)更多集中到不同植物HSP70基因的分離與克隆上,借助生物信息學(xué),預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu),研究基因的功能.同時(shí),HSP基因的表達(dá)調(diào)控將成為新的研究熱點(diǎn).不過(guò),植物界應(yīng)對(duì)高溫脅迫進(jìn)化了一套復(fù)雜的適應(yīng)機(jī)制,遠(yuǎn)不止HSP就能完全解答.因此,只有更全面地研究和了解植物的抗熱機(jī)制,才能更有效地實(shí)現(xiàn)通過(guò)遺傳改良提高植物的抗熱性.

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（責(zé)任編輯：鄧天福）

Advance of heat shock protein 70（HSP70）in plant

Du Xiaohua,Huang Lingli,Liu Huichao
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Heat shock protein is a kind of protein to protect the organisms under stress,it was studied widely and deeply on the HSP70 family,which were one of the main chaperones.The classification,distribution,structure,function of HSP70 in plant,the genetic characteristics and the control of gene expression were reviewed in this paper.It could provid some basis knowledge for improving the tolerance of plants,preventing and controlling the plants disease and plant transgenetic technology.

heat shock protein 70；distribution；structure；function

Q51

A

1008-7516（2014）03-0016-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.03.004

2014-04-11

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（132102110119）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（13B210009）

杜曉華（1972-）,男,陜西岐山人,博士,副教授.主要從事觀賞植物種質(zhì)資源研究.

劉會(huì)超（1964-）,男,河南南陽(yáng)人,博士,教授,碩士生導(dǎo)師.主要從事觀賞植物生物技術(shù)育種研究.