王勇生，程宗佳

（中糧營養(yǎng)健康研究院動物營養(yǎng)與飼料中心，北京 102209）

蛋白質(zhì)營養(yǎng)實際上是氨基酸營養(yǎng)。蛋白質(zhì)在動物消化酶作用下的水解終產(chǎn)物大部分是由2或3個氨基酸殘基組成的小肽，能直接被動物吸收，參與生理活動和代謝調(diào)節(jié)。大豆蛋白活性肽是大豆蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，通過微生物發(fā)酵技術(shù)將大豆蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成多肽、寡肽以及小部分氨基酸混合物，通常平均肽鏈長度為2～10的短肽（以長度為2～3的低分子肽為主），含少量的游離氨基酸、糖類和無機鹽，相對分子質(zhì)量＜1 000，主要溶出峰位置在相對分子質(zhì)量為300～700。與大豆蛋白質(zhì)相比，大豆多肽含豐富的小肽，更易消化吸收，具有低過敏性，能促進礦物質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)元素的吸收及抗氧化等特性。幼畜（對于早期斷奶的動物）的消化酶系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對于植物蛋白質(zhì)的消化能力較弱，而大豆肽中富含許多小肽，且大豆肽抗原性較低，能直接被動物吸收，因而幼畜使用后發(fā)生過敏反應(yīng)的概率大幅降低。本文就大豆肽的生理功能和制備工藝進行論述，以期為大豆肽作為飼料資源的開發(fā)使用，改善動物的生產(chǎn)性能提供指導(dǎo)。

1 大豆肽的生理功能

1.1 降低膽固醇

大豆肽能刺激甲狀腺激素分泌，促使膽固醇代謝生產(chǎn)膽汁酸。膽汁酸又被食物纖維所吸附，排出體外從而阻礙對膽固醇的吸收，起到降低膽固醇的作用[1]。對于膽固醇值高的人有降低總膽固醇作用，對于正常人無降低作用，還可以預(yù)防患者在食用高膽固醇食品時所引起的膽固醇升高的現(xiàn)象。在細胞和試驗動物模型中研究表明，大豆蛋白作用機制與直接激活肝細胞中的低密度脂蛋白受體或者基因表達有關(guān)[2-3]?；蚺c大豆蛋白中特殊比例的氨基酸調(diào)控低密度脂蛋白合成與代謝有關(guān)[4-5]。Lovati等研究表明，大豆蛋白中的主要小肽（即7S球蛋白），無異黃酮元件，在HepG2細胞中可抑制載脂蛋白B分泌和甾醇生物合成[2,6]。在Ⅱ型糖尿病小鼠中的研究表明，大豆蛋白水解產(chǎn)物不僅能抑制脂質(zhì)的吸收，增加碳水化合物的吸收而且增強餐后食物中的碳水化合物的氧化，增加能量消耗[7]。

1.2 促進脂肪代謝

Nagasawa等報道，大豆蛋白肽可以降低脂肪組織中甘油三酯含量和脂肪酸合成酶mRNA水平，表明大豆分離蛋白控制脂肪組織中基因的表達，并有效調(diào)節(jié)脂肪細胞分化[8]。此外，黑色大豆肽可降低肥胖發(fā)生率，起到降低體重，減少脂肪合成作用，有減少體重和脂肪組織重量的優(yōu)點。Kim等從大豆中獲得一種三肽，經(jīng)過Western blot分析表明，合成肽與5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR）具有相似的抑制效果，可以抑制脂肪細胞標(biāo)記物和脂肪細胞分化因子的表達分化[9]。高長城等報道，給小白鼠飼喂大豆肽時能刺激產(chǎn)生熱能的褐色脂肪組織BAT的活性，提高甲狀腺在血液中的濃度，并隨大豆肽服用量的增加而提高[10]。

1.3 抗氧化功能

高水平的活性氧可導(dǎo)致機體DNA、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物的損害[11]。大豆蛋白水解物中含有抗氧化肽，這些肽具有很高的活性，可抑制亞油酸的過氧化，緩解百草枯誘導(dǎo)大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，清除過氧化亞硝酸鹽、活性氧和自由基物質(zhì)[12-13]。因此，可能有助于預(yù)防一些自由基有關(guān)的疾病。Chen等從大豆蛋白質(zhì)的酶解液中分離得到6種具有抗氧化性的多肽，發(fā)現(xiàn)此類多肽由5～16個氨基酸殘基組成，其中包括疏水的氨基酸、纈氨酸或亮氨酸在N-末端，然后在肽段順序上是脯氨酸、組氨酸或酪氨酸。其共同特點為含有較多的組氨酸和酪氨酸，推測其抗氧化性主要是由于組氨酸和酪氨酸能消除自由基或整合金屬離子。

1.4 增強免疫功能

Dilshat等研究表明，當(dāng)人體淋巴細胞較多時，大豆肽可以降低人體淋巴細胞數(shù)目，同時粒細胞數(shù)目也會增多；當(dāng)人體粒細胞較多時，大豆肽可以提高淋巴細胞數(shù)目，同時粒細胞也有增多趨勢，并且大豆肽可顯著提高CD11b+和CD56+數(shù)目（P＜0.05）[14]。Takahiro等在大豆蛋白的胰蛋白酶水解液中提取得到一種肽soymetide-13（來源于β-伴大豆球蛋白的α'亞基），具有刺激中性粒細胞的吞噬功能，soymetide-13的N-末端對這種刺激作用起主要作用，在去除C-末端后，發(fā)現(xiàn)soymetide-4是所需吞噬刺激作用的最小結(jié)構(gòu)[15]。李紅勝等研究了大豆肽對小鼠免疫器官和免疫功能的影響，結(jié)果表明，日糧中添加大豆肽可顯著提高小鼠免疫器官指數(shù)，增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性，激發(fā)小鼠抗雞紅細胞抗體的產(chǎn)生，說明大豆肽對免疫小鼠抗雞紅細胞抗體的產(chǎn)生具有明顯的激發(fā)作用，可在一定程度上提高小鼠特異性免疫功能[16]。

1.5 促進鈣及微量元素吸收作用

由于大豆蛋白中植酸、草酸、纖維、單寧及其他多酚的存在，顯著抑制了動物對鈣、鋅、銅、鎂和鐵的生物利用率。研究表明，大豆肽能與鈣及其他微量元素有效結(jié)合成活性基團，可以形成有機鈣多肽絡(luò)合物，使溶解性、吸收率和輸送速度都明顯提高，能促進鈣的被動吸收。此外，大豆肽還能與鐵、銅、硒、鎂和錳等多種微量元素結(jié)合，形成有機金屬絡(luò)合肽，是吸收和輸送微量元素很好的載體。李迪等研究了不同大豆肽制備鈣肽復(fù)合物的溶解性和穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BML-Ca溶解性最好，濃度為200～300mg·mL-1滅菌效果最好[17]。盧建國等研制出的富硒大豆肽膠囊和富硒大豆肽飲料，均有利于人體對硒的吸收[18]。

2 大豆肽的物理化學(xué)制備工藝

制備大豆肽的原料主要有大豆分離蛋白、大豆粉和大豆粕3種。生產(chǎn)所采用的方法有化學(xué)水解法、酶水解法和微生物發(fā)酵法。目前，應(yīng)用這些方法已獲得一定數(shù)量具有生物活性大豆肽產(chǎn)物。因不同的方法具有不同的工藝條件選擇，所獲得大豆肽的純度、理化性質(zhì)和功能活性各有不同。大豆中獲得的不同生物活性肽見附表[19－26]。

2.1 化學(xué)水解法

化學(xué)水解法包括酸水解法和堿水解法，即采用酸、堿化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子多肽物質(zhì)。酸堿水解法相對簡單，生產(chǎn)成本低，但存在許多缺點，如水解工藝很難控制，水解無特異性，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，氨基酸易遭到破壞，營養(yǎng)成分損失，對環(huán)境污染大等。因此，目前的研究進展相對緩慢。

附表 大豆中獲得的不同生物活性肽

2.2 酶水解法

酶水解法是利用蛋白酶在最適溫度和pH條件下進行大豆蛋白酶解反應(yīng)，把大分子蛋白降解為小分子肽類，再經(jīng)加工精制生產(chǎn)出大豆肽產(chǎn)品。常用的蛋白酶主要有動物蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等及微生物蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶、放線菌蛋白酶、棲土曲霉蛋白酶、黑曲霉蛋白酶和地衣型芽孢桿菌蛋白酶等。酶解法生產(chǎn)多肽產(chǎn)品安全性高，人體易消化吸收，蛋白質(zhì)利用率高，且生產(chǎn)條件溫和，易控制，已逐漸成為應(yīng)用最廣泛的大豆肽制備方法。但酶水解法制備的大豆肽會產(chǎn)生苦味，其中的苦味物質(zhì)主要是亮氨酸、蛋氨酸等疏水性氨基酸及其衍生物和一些小分子的肽類。此外，高價格酶制劑的使用也提高了大豆肽的生產(chǎn)成本。

酶水解法可分為單酶水解法、雙酶水解法和復(fù)合酶水解法。在酶解法生產(chǎn)大豆肽的初期研究中，一般采用單酶水解法生產(chǎn)大豆肽，但苦味明顯，加入外切酶水解后，苦味變?nèi)?。多酶?fù)合水解工藝比單酶水解復(fù)雜，底物濃度、酶解時間、pH、溫度、酶的配比及加入酶的方式等因素都要嚴格考慮。多酶復(fù)合水解的水解度要高于單酶，能將大豆蛋白降解為相對分子質(zhì)量小的短肽，使苦味不明顯。

2.3 微生物發(fā)酵法

目前，通過微生物發(fā)酵產(chǎn)酶，進而水解大豆蛋白生產(chǎn)大豆肽被認為是一種較先進且極其有效的生產(chǎn)活性肽方法。生物活性肽能夠在微生物代謝活動中產(chǎn)生的混合酶作用下釋放出來，同時微生物可借助多肽水解液提高生長及產(chǎn)酶能力，循環(huán)協(xié)作，效率更高。此法生產(chǎn)的大豆肽不是簡單地將大豆蛋白質(zhì)切成小肽，而是將釋放的小肽通過移接和重排，經(jīng)過微生物作用對某些苦味基團進行修飾、轉(zhuǎn)移和重組，使制得的大豆肽具有更好的溶解性，無苦味，增強其應(yīng)用價值。應(yīng)用較廣的微生物主要有棲土曲霉3942、枯草桿菌1389、地衣芽抱桿菌2709、黑曲霉3350和放線菌166等。微生物發(fā)酵法制備大豆肽的原料成本低廉、工藝過程簡單、條件溫和、發(fā)酵效率高。我國近年來在此領(lǐng)域開展了較多研究，并已獲得了利用復(fù)合菌發(fā)酵大豆粕制備大豆肽的最佳工藝條件，成本低、效率高、產(chǎn)品品質(zhì)好。

3 大豆肽的基因表達制備策略

近年來，從大豆中分離獲得的各種小分子肽蛋白都表現(xiàn)出各種生理活性，如調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)、激活細胞免疫機制、改善心血管系統(tǒng)等。這些發(fā)現(xiàn)對功能性食品和新藥物的開發(fā)非常有價值。利用基因工程技術(shù)在微生物中進行異源蛋白質(zhì)的表達是現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)和利用的熱點。依據(jù)生產(chǎn)效率、生物活性、蛋白質(zhì)的理化特性來選擇合適的表達系統(tǒng)。Itakura等利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)了哺乳動物肽類激素在外源基因的體外表達[27]。在一般情況下，3種形式的外源蛋白質(zhì)可以在大腸埃希氏菌中表達：融合蛋白、分泌蛋白和包涵體。大腸桿菌可進行翻譯后修飾，例如，N-O-連接糖基化、脂肪酸?；?、磷酸化、二硫鍵形成，構(gòu)成正確的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)以及所需蛋白質(zhì)的功能特性。顯然，這些修飾可以影響到生物活性、功能、結(jié)構(gòu)、溶解性、穩(wěn)定性、半衰期、蛋白酶阻力。Liu等試驗表明，已成功利用了商業(yè)大腸桿菌表達系統(tǒng)表達重組lunasin大豆肽蛋白[28]。

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