葉洪楠，游 珂，郭艷利，張小為，耿 力，李子健

(北京大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100191)

宮頸癌是第二常見的女性惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約50萬例，其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家;我國每年新發(fā)病例約14萬，約占世界宮頸癌新發(fā)病例的28.8%［1-2］。從宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)到宮頸浸潤癌是一個連續(xù)的發(fā)展過程。大量臨床研究證實，由高危型HPV感染進展為宮頸原位癌(Cervical cancer insitu，CIS)大約需要7～12年的時間［3］。因此早期篩查、早期診斷和早期治療在宮頸癌的防治工作中顯得尤為重要。P16INK4a基因是一種直接作用于細胞周期、抑制細胞分裂的抑癌基因。Ki67是一種核增殖標志基因，屬于非組蛋白抗原，其表達水平的高低對評價細胞增殖活性、研究腫瘤的生物學行為和預后具有重要意義［4］。目前國內(nèi)外研究普遍認為P16INK4a與Ki-67兩種標記物在組織學中可以用于宮頸癌的輔助診斷、治療效果的評價及預后判斷［5-8］，但在宮頸細胞學中P16INK4a、Ki-67免疫細胞化學檢測對提高宮頸高級別病變的檢出作用還有待于研究。我們應用宮頸液基細胞學剩余標本進行P16INK4a及Ki-67免疫細胞化學檢測，并與高危型HPV的檢測結(jié)果進行比較，探討其作為檢出宮頸癌前病變的輔助方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2010年1月至2012年6月間，選取北京大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科門診因?qū)m頸細胞學異常就診并進行陰道鏡檢查及宮頸活檢者50例。按照病理學診斷分為慢性炎癥、CIN1、CIN2、CIN3。根據(jù)2001年美國陰道鏡檢查與子宮頸病理學會(ASCCP)共同制定出的宮頸癌前病變處理指南，CIN1級可以隨診觀察為主，CIN2級及CIN3級危險度較高，需進行相應治療。故本研究中，我們將CIN2級以下26例患者歸為低級別病變組，CIN2級及以上24例患者歸為高級別病變組。

1.2 標本處理

采用宮頸液基細胞學剩余標本，使用 Auto PREP薄層細胞制片系統(tǒng)制成薄層細胞學涂片，95%酒精室溫固定72小時，10%中性甲醛固定30分鐘，室溫下蒸餾水沖洗5分鐘。放入5%EDTA(pH8.0)中用微波爐強力高火檔10分鐘行抗原修復。室溫自然冷卻后，0.3%過氧化氫室溫下孵育15分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS洗片3次。

1.3 免疫細胞化學檢測及結(jié)果判斷

免疫細胞化學染色具體實驗步驟如下:1、取出冷藏的TCT涂片，室溫放置1小時;2、用PBS(PH=7.4)沖洗涂片3次，每次2分鐘;3、每張涂片滴加100μl的3%過氧化氫溶液，室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化酶活性;4、0.01M PBS沖洗3次，每次2 分鐘;5、0.01mol/L 枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)在97°C水浴鍋孵育半小時，以恢復抗原性;6、待涂片恢復常溫，每張涂片滴加100μl的第一抗體，4℃冷室過夜;7、0.01M PBS沖洗3次，每次2分鐘。甩去PBS，每張涂片加兩滴或100μl的聚合物增強劑(試劑 A)，室溫下孵育20分鐘;8、PBS沖洗3次，每次2分鐘。甩去PBS，每張涂片滴加100μl的酶標抗兔聚合物(試劑 B)，室溫下孵育30分鐘;9、PBS沖洗3次，每次2分鐘。甩去PBS，每張涂片滴加100μl新鮮配制的DAB顯色液，顯色3～5分鐘，蘇木素復染45秒鐘，0.5%鹽酸酒精分化，逐級酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

結(jié)果判定:采用半定量的方法統(tǒng)計陽性細胞數(shù)目，具體操作方法為選取代表性的幾個高倍視野計數(shù)300個細胞，計算著色鱗狀上皮細胞所占比例，并乘以100作為Ki-67的標記指數(shù)［9-10］，p16采用相同的方法。

1.4 診斷標準

液基細胞學采用2001年TBS(The Bethesda System，伯塞斯達系統(tǒng))診斷標準。

1.5 高危型HPV-DNA檢測

采用免疫捕獲雜交二代(Hybird Capture II，HCII)法。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。由于P16INK4a及Ki-67的原始數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，故進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，獲得新變量lgP16INK4a及l(fā)gKi-67后，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，進行后續(xù)統(tǒng)計分析。采獨立樣本t檢驗及單因素方差分析比較不同組別P16INK4a及Ki-67的表達，當 P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。對P16INK4a及Ki-67的表達繪制ROC曲線，并根據(jù)靈敏度和特異度之和最大的原則選取相應界值及計算相關(guān)統(tǒng)計學指標。

2 結(jié)果

2.1 細胞學與宮頸組織病理學診斷

50例患者中，細胞學診斷為ASC-US(atypical squamous cells of undetermined significance，診斷意義不明的不典型鱗狀細胞)、LSIL(low-grade squamous intraepithelial lesion，低度鱗狀上皮內(nèi)病變)和HSIL(high-grade squamous intraepithelial lesion，高度鱗狀上皮內(nèi)病變)的分別為27例、10例和13例，其與組織病理學診斷結(jié)果的對應關(guān)系見表1。

表1 細胞學診斷與組織病理學關(guān)系

2.2 高危型HPV預測ASC-US患者中高級別宮頸病變準確度

27例ASC-US中高危型HPV陽性23例，組織病理學診斷CIN2及以上病變共11例(見表2)，由表1計算得出高危型HPV預測高級別病變的敏感度為1(11/11)、特異度為0.25(4/16)、陽性預測值為0.478(11/23)、陰性預測值為1(4/4)。

表2 ASC-US中高危型HPV檢測與宮頸組織病理學的關(guān)系

2.3 P16INK4a檢測預測宮頸異常細胞學及ASC-US患者中高級別宮頸病變準確度

2.3.1 P16INK4a表達與宮頸組織病理學診斷的關(guān)系 在CIN2及以上組和CIN2以下組中，P16INK4a的表達量差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.811，P＜0.05)，在炎癥組 CIN1組、CIN2 組、CIN3 組中，其表達量隨CIN級別升高而升高，且組間差異有統(tǒng)計學意義(F=16.094，P ＜0.01)(見圖1，表3)。

圖1 P16INK4a表達與宮頸組織病理學診斷的關(guān)系

表3 P16INK4a的表達

2.3.2 P16INK4a在宮頸異常細胞學及 ASC-US 中對高級別病變預測的準確性 對于全部50例樣本中P16INK4a的表達繪制ROC曲線，以敏感度及特異度的和最大為標準確定界值，選取12.25為界值(見圖2)。在全部50例異常細胞學樣本中P16INK4a預測高級別病變的敏感度為0.792(19/24)、特異度為0.808(21/26)、陽性預測值為 0.792(19/24)、陰性預測值為0.808(21/26)(見表4);在27例 ASCUS樣本中P16INK4a預測高級別病變的敏感度為1(11/11)、特異度為 0.875(14/16)、陽性預測值為0.846(11/13)、陰性預測值為1(14/14)(見表5)。

圖2 P16INK4a表達在異常細胞學中檢出高級別病變的ROC曲線

表4 異常細胞學中P16INK4a表達量與宮頸組織病理學關(guān)系

表5 ASC-US中P16INK4a表達量與宮頸組織病理學關(guān)系

2.4 Ki-67檢測預測宮頸異常細胞學及ASC-US患者中高級別宮頸病變的準確性

2.4.1 Ki-67表達與宮頸組織病理學診斷的關(guān)系

在CIN2及以上組和CIN2以下組中，Ki-67的表達量差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.698，P ＜0.05)，其中炎癥組、CIN1組、CIN2組、CIN3組中，其表達量隨CIN級別升高而升高，且組間差異有統(tǒng)計學意義(F=15.177，P ＜0.01)(見圖 3，表6)。

圖3 Ki-67表達與宮頸組織病理學診斷的關(guān)系

表6 宮頸不同病變Ki-67的表達

2.4.2 Ki-67在宮頸異常細胞學及ASC-US中對高級別病變預測的準確性 對于全部50例樣本中Ki-67的表達繪制ROC曲線，以敏感度及特異度的和最大為標準確定界值，選取12.5為界值(見圖4)在全部50例異常細胞學樣本中，Ki-67預測高級別病變的敏感度為0.708(17/24)、特異度為0.846(22/26)、陽性預測值為 0.810(17/21)、陰性預測值為0.759(22/29)(見表7);在27例 ASC-US樣本中Ki-67預測高級別病變的敏感度為0.818(9/11)、特異度為 0.875(14/16)、陽性預測值為 0.818(9/11)、陰性預測值為0.875(14/16)(見表8)。

圖4 Ki-67表達在異常細胞學中檢出高級別病變的ROC曲線

表7 異常細胞學中Ki-67表達量與宮頸組織病理學關(guān)系

表8 ASC-US中Ki-67表達與宮頸組織病理學學診斷的關(guān)系

2.5 P16INK4a及Ki-67與高危型HPV在ASC-US中分流管理作用的比較

2.5.1 P16INK4a與高危型 HPV 在 ASC-US 中分流管理作用的比較 通過表9可以看出，P16INK4a檢測在ASC-US中預測宮頸高級別病變的特異度和陽性預測值均顯著高于高危型HPV檢測;敏感度和陰性預測值二者相當。

表9 P16INK4a和高危HPV檢測在ASC-US中的分層價值比較

2.5.2 Ki-67與高危型HPV在ASC-US中的分流管理作用的比較 通過表10可以看到，Ki-67檢測在ASC-US中預測宮頸高級別病變的特異度和陽性預測值均顯著高于高危型HPV檢測;敏感度和陰性預測值略低于高危型HPV。

表10 Ki-67和高危HPV檢測在ASC-US中的分層價值比較

3 討論

目前對宮頸癌前病變的早期篩查主要采用細胞學檢測，液基細胞學檢測(liquid based cytology test，LCT)彌補了傳統(tǒng)細胞涂片法的一些不足，能較為有效地篩檢宮頸癌前病變及早期宮頸癌，但是該方法存在一定的假陰性和假陽性，會造成一部分高危患者的漏診，因此需要通過聯(lián)合一些輔助診斷，提高細胞學篩查的準確性。將P16INK4a及Ki-67作為診斷宮頸病變的標記物已經(jīng)得到普遍認可［11-12］。之前的研究多采用免疫組化的方法對P16INK4a及Ki-67進行檢測，免疫組化檢測需活檢組織，對患者有一定的創(chuàng)傷，且存在一定比例的假陰性和假陽性。與組織學標本相比，采用宮頸脫落細胞檢測P16INK4a、Ki-67，不僅具有取材方便、無創(chuàng)的特點，同時又可以極大的減小細胞學單純依賴細胞形態(tài)學改變?yōu)樵\斷依據(jù)對結(jié)果帶來的主觀影響。因此，這一新方法對降低傳統(tǒng)宮頸癌篩查法的假陽性率和假陰性率，提高篩查的敏感度和特異度都具有重要意義。

本研究顯示，P16INK4a的表達水平隨著宮頸病變級別的升高而提高。近年研究表明，在幾乎所有HPV陽性的宮頸癌及癌前病變中P16INK4a呈高表達，且細胞學診斷為HSIL的表達率顯著高于LSIL的表達率［13］。Horn等［14］研究表明，P16INK4a蛋白表達可作為判斷宮頸癌惡性程度的指標。Juric等［15］研究顯示，P16INK4a過表達對診斷宮頸高危病變及宮頸癌具有重要價值，這些研究均支持我們的研究結(jié)果。本研究中，Ki-67的表達水平隨著宮頸病變級別的升高而提高。其他研究表明，隨著宮頸上皮細胞病變程度增加，其表達率明顯升高［16］。正常情況下，Ki-67表達于成熟宮頸鱗狀上皮的基底細胞和基底旁細胞，隨著宮頸癌前病變的加重，Ki-67的表達向上皮表層上移，其在鱗狀上皮上2/3層生的表達被認為提高了CIN診斷的特異度［17］。這些均與我們的結(jié)果一致。易為等［18］研究還發(fā)現(xiàn)，Ki-67單獨用于診斷宮頸病變漏診率小，但誤診率高。

由于宮頸脫落細胞中P16INK4a及Ki-67的表達水平隨宮頸病變級別升高而升高，因此我們需要找到一個臨界點，使P16INK4a及Ki-67診斷宮頸高級別病變的靈敏性和特異度有最佳的結(jié)合?！敖邮苷卟僮魈匦郧€(ROC曲線)”是一種反應某個診斷指標的效度的方法，也是確定最佳診斷參考值的有效方法。ROC曲線下面積(AUC)可用于評價診斷準確性，其值在0.5至1之間。AUC越接近于1，說明診斷效果越好。本研究所有病例的P16INK4a的界值為12.25，ROC曲線下面積達到0.848(95%可信區(qū)間0.734 ～0.961，p＜0.05);Ki-67 的界值為 12.5，ROC曲線下面積達到0.856(95%可信區(qū)間0.753～0.959，p＜0.05)。以上結(jié)果說明通過免疫細胞化學方法檢測宮頸脫落細胞P16INK4a及Ki-67的表達水平對檢出宮頸高級別病變具有很好的效度。我們比較了P16INK4a及Ki-67對于異常細胞學以及ASCUS中高級別病變預測的準確性。我們發(fā)現(xiàn)，細胞學診斷為ASC-US的P16INK4a及Ki-67對高級別病變預測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均要優(yōu)于異常細胞學，這說明相對于LSIL及HSIL，P16INK4a及Ki-67對于ASC-US中高級別病變預測的準確性更高。

大量研究結(jié)果表明，ASC-US可能是反應性變化，也可能隱藏著宮頸病變［19］。Srodon等［20］研究認為，宮頸細胞學檢查為ASC-US的患者中有5%～10%為宮頸高級別病變，宮頸浸潤癌約占0.1%。對于ASC-US病例若只進行隨訪，部分患者會喪失最佳治療時機;若全部直接進行陰道鏡檢查及宮頸活檢，又會使大量良性病變患者承受不必要的檢查，造成醫(yī)療資源的浪費。有研究表明在ASC-US中，高危型HPV檢測相對于細胞學檢測其檢出高級別病變的敏感度可以提高10% ～15%［21］，因此高危型HPV檢測對于ASC-US具有分流管理的作用。本研究病例中，ASC-US中高危型HPV檢測CIN2及以上病變的敏感度為1、特異度為0.25、陽性預測值為0.478、陰性預測值為1?？梢姼呶Ｐ虷PV檢測在ASC-US中檢出高級別病變具有令人滿意的靈敏度和陰性預測值，但特異度和陽性預測值不盡如人意。另有報道稱HPV檢測和細胞學篩查聯(lián)合后雖然提高了檢出高級別病變的敏感度，但降低了特異度［22-23］。因此有必要尋找一種具有更高特異度和陽性預測值的生物學指標。在本研究中，我們比較了高危型HPV檢測和P16INK4a、Ki-67檢測在預測ASC-US中高級別病變的準確性的差異，發(fā)現(xiàn)P16INK4a及Ki-67檢測的特異度和陽性預測值明顯高于高危型HPV，而敏感度、陰性預測值兩者相當。這說明單獨應用P16INK4a或Ki-67免疫細胞化學檢測對ASC-US中高級別病變進行預測不僅保留了高危型HPV檢測較高的敏感度和陰性預測值，同時彌補了高危型HPV檢測在特異度和陽性預測值上的不足，因此單獨應用P16INK4a或Ki-67免疫細胞化學檢測對ASC-US中高級別病變進行預測其準確性要優(yōu)于單獨應用高危型HPV檢測。

綜上，高危型HPV檢測對細胞學診斷為ASCUS的患者的進一步處理具有分流管理的意義，但存在低特異度和低陽性預測值的缺陷。本研究表明，單獨應用P16INK4a或Ki-67免疫細胞化學檢測對ASC-US中高級別病變的檢出作用均要優(yōu)于高危型HPV檢測。因此本研究提示宮頸脫落細胞P16INK4a及Ki-67免疫細胞化學檢測相比于高危型HPV檢測可以提高對ASC-US中高級別病變的檢出作用。后續(xù)我們還需要更大樣本量的臨床觀察和實驗來驗證此結(jié)論。

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