占汝真，武 健，付成鈺，方麗穎，王 吉，歐陽(yáng)杰，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京100083）

葉綠素是一種從綠葉中提取的天然食用色素，其安全無(wú)毒，除被廣泛用作食品、化妝品的著色劑外，還具有抗誘變、抗氧化等活性[1]。但是，葉綠素不穩(wěn)定且不溶于水，所以常常將其制成葉綠素銅鈉鹽以提高其穩(wěn)定性。葉綠素銅鈉鹽是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）和我國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)批準(zhǔn)使用的天然綠色素，也是我國(guó)食品工業(yè)中唯一允許使用的綠色素[2-4]。但基于Cu2+的毒性，如果能將葉綠素制成其他金屬鹽，安全性將更高。鋅是人體所必需的微量元素，是體內(nèi)多種酶的組成部分，參與機(jī)體內(nèi)的各種新陳代謝，若將葉綠素改造為葉綠素鋅鈉鹽，可以使其兼具色素和鋅制劑的雙重作用[5]。同樣，制備出葉綠素鐵鈉，也可作為一種具有補(bǔ)鐵保健功能的天然綠色色素。葉綠素鐵鈉具有抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏和促進(jìn)組織再生等作用，是一種良好的造血細(xì)胞復(fù)合劑，對(duì)各種原因引起的白細(xì)胞減少癥及各種貧血有治療作用[6-7]。

迄今為止，從毛竹、紅松、榆樹(shù)等葉子制備葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉已經(jīng)有了一定的研究，還有人利用蠶砂制備葉綠素鐵鈉，其葉綠素含量約為1%[8]，但蠶砂只分布于南方養(yǎng)蠶的地區(qū)。我國(guó)松樹(shù)資源分布廣泛，松針葉綠素具有抗菌、止血、降血壓、刺激細(xì)胞生成和清除體內(nèi)超氧自由基等作用[9-10]。

此外，國(guó)內(nèi)外有部分針對(duì)葉綠素鈉鹽穩(wěn)定性的研究，但將三者穩(wěn)定性進(jìn)行對(duì)比的較少，且采用的方法是在實(shí)驗(yàn)處理一段時(shí)間后進(jìn)行一次測(cè)定，無(wú)法確定三種葉綠素鈉鹽穩(wěn)定性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)生的影響。因此，本研究以松針為原料制備葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉，并比較它們對(duì)光、熱、pH和氧化劑在一段時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松針 采摘于北京地區(qū)的馬尾松；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、石油醚、硫酸、鹽酸、丙酮、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸亞鐵 均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

UV2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉的制取

1.2.1.1 松針的預(yù)處理 將新鮮松針用水洗凈風(fēng)干，再用60℃熱風(fēng)烘干至含水率12%左右；除去發(fā)黃的松針，粉碎后過(guò)60目篩，即得松針?lè)?，備用?/p>

1.2.1.2 葉綠素的萃取 稱取100g松針?lè)?，將其置?000mL燒杯中，加入450mL無(wú)水乙醇和50mL水拌勻，靜置12h，再用閃式提取器提取300s，抽濾；把濾液轉(zhuǎn)入蒸餾裝置濃縮，55℃減壓蒸餾，蒸至原濾液體積的1/3，即得葉綠素軟膏，其主要成分有葉綠素、β-胡蘿卜素、葉黃素等。

1.2.1.3 皂化分離提純?nèi)~綠酸鈉 向葉綠素軟膏中加入0.3mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10～11，65℃皂化40min，稍冷卻轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入等體積的石油醚，激烈振搖，以萃取其中不皂化物。靜止分層，上層的石油醚層主要含未皂化的葉黃素、β-胡蘿卜素等，下層為已轉(zhuǎn)變的葉綠素鈉鹽——葉綠酸鈉。

1.2.1.4 葉綠素銅鈉、鋅鈉和鐵鈉的制備 將上述葉綠素鈉鹽用0.5mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為6.0～6.5，65℃攪拌1h，此時(shí)生成脫鎂葉綠素鈉。再調(diào)節(jié)pH為2.0～3.0，攪拌反應(yīng)1h。再滴加20g/100mL CuSO4溶液，逐漸析出結(jié)晶；當(dāng)整體顏色由黃綠色變成墨綠色時(shí)，再多加2～3mL CuSO4液體，結(jié)晶1h，過(guò)濾、水洗、干燥得葉綠素銅酸[11]。將上述葉綠素銅酸溶于適量丙酮中，加入5%NaOH-乙醇溶液，隨著溶液的加入葉綠素銅酸逐漸溶解，當(dāng)調(diào)至pH=10.0時(shí)，又開(kāi)始變稠，析出結(jié)晶，調(diào)到pH=11.0時(shí)結(jié)晶1h，過(guò)濾、用丙酮洗滌三次、真空干燥得藍(lán)黑色的葉綠素銅鈉結(jié)晶[12]。分別用ZnSO4和FeSO4代替CuSO4，以同樣的方法分別制備得到墨綠色有金屬光澤的葉綠素鋅鈉和墨色有金屬光澤葉綠素鐵鈉結(jié)晶[13-14]。

1.2.2 紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜的測(cè)定 將按上述制得的葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉鹽加蒸餾水配成一定濃度溶液，以蒸餾水作參比，分別在200～700nm波段進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.3 葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的穩(wěn)定性研究 分別將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成1×10-4g/mL的溶液，分別：a.置于黑暗、實(shí)驗(yàn)室自然光（500Lux）和燈箱（4000Lux）中；b.置于50、60、70、80℃下；c.各用HCl和NaOH調(diào)節(jié)成pH為3.0、5.0、7.0、10.5和12.5；d.以H2O2（30%）為氧化劑，配制含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)H2O2的葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉稀溶液。每隔一定的時(shí)間間隔，分別在其最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

保存率（%）=色素溶液不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光值/色素溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的初始吸光值×100

2 結(jié)果與討論

2.1 從松針制備葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉

以松針為原料，經(jīng)過(guò)葉綠素提取、皂化、酸化、銅代（或鋅代、鐵代）、加堿成鹽等步驟，可分別制得葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉。其中，葉綠素銅鈉為墨綠色具有金屬光澤的結(jié)晶，以松針原料計(jì)產(chǎn)品得率為1.99%，其水溶液呈深綠色；葉綠素鋅鈉為綠色具有金屬光澤的結(jié)晶，得率為1.74%，水溶液呈翠綠色；葉綠素鐵鈉為黃褐色具有金屬光澤的結(jié)晶，得率為2.24%，水溶液呈茶黃色。

2.2 葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

圖1 紫外-可見(jiàn)光吸收?qǐng)D譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra

葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖1所示。葉綠素銅鈉的最大吸收波長(zhǎng)為402nm，葉綠素鋅鈉的最大吸收波長(zhǎng)為415nm，葉綠素鐵鈉在405nm處有一微弱吸收峰。文獻(xiàn)中，葉綠素銅鈉的最大吸收波長(zhǎng)為405nm和630nm[15]，葉綠素鋅鈉的最大吸收波長(zhǎng)為410nm[16]，葉綠素鐵鈉的最大吸收波長(zhǎng)為405nm，三者的最大吸收波長(zhǎng)均與文獻(xiàn)中的較為一致[17]。

2.3 光照對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響

將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉放置在不同光照條件下檢查其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖2。葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉在黑暗條件下穩(wěn)定性較好，10h后保存率均在80%以上；在室內(nèi)自然光和強(qiáng)光照射下，三者均加快分解，其中葉綠素銅鈉的穩(wěn)定性最好，自然光照10h后保存率為78.76%，強(qiáng)光照射10h后保存率為73.24%。葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的光穩(wěn)定性明顯不如葉綠素銅鈉。

圖2 不同光照條件對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of light irradiation on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin and sodium iron chlorophyllin

2.4 溫度對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響

將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉放置在不同溫度條件下檢查其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3。葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉在50℃下穩(wěn)定性較好，其中葉綠素鋅鈉的穩(wěn)定性最好，12h后保存率為88.99%，葉綠素銅鈉12h后的保存率為80.49%。在70℃以下葉綠素鋅鈉和葉綠素銅鈉的保存率均在80%以上。葉綠素鐵鈉對(duì)溫度的穩(wěn)定性較差，70℃條件下12h后保存率只有57.40%。超過(guò)80℃后，三者均分解加劇，溶液褪色[18-19]。

圖3 不同溫度對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of heat treatment on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin and sodium iron chlorophyllin

2.5 pH對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響

葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成一定濃度溶液后為堿性溶液，再將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成不同pH溶液檢查其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖4。pH的變化會(huì)引起葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的異構(gòu)化。對(duì)于葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉來(lái)說(shuō)pH越高，異構(gòu)化后得到的物質(zhì)吸光值越大，在酸性條件下，溶液的吸光值降低，且酸度越高，溶液的顏色越淺，吸光值越小。

圖4 不同pH對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different pH on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin，and sodium iron chlorophyllin

2.6 不同濃度氧化劑對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響

將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成含有不同濃度H2O2的溶液，檢查其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖5。H2O2會(huì)使葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉分解，且濃度越高分解越劇烈。在不同濃度情況下，葉綠素鐵鈉相對(duì)較為穩(wěn)定，葉綠素銅鈉穩(wěn)定性較差。當(dāng)H2O2的溶液濃度為0.02%時(shí)，8h后葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的保存率均在50%左右；當(dāng)H2O2的溶液濃度為0.1%時(shí)，8h后只有葉綠素鐵鈉的保存率大于50%；當(dāng)H2O2的溶液濃度為0.5%時(shí)，8h后葉綠素鐵鈉的保存率為46.21%，而葉綠素銅鈉只有21.17%。

3 結(jié)論

以松針為原料制備葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的得率分別為1.99%、1.74%和2.24%。相比之下，葉綠素銅鈉的光穩(wěn)定性較好，葉綠素鋅鈉對(duì)溫度的穩(wěn)定性好，葉綠素鐵鈉對(duì)氧化穩(wěn)定性較好。從顏色來(lái)考慮，葉綠素鋅鈉的水溶液顏色為翠綠色，與葉綠素銅鈉的顏色相差不大，且其具有色素和鋅劑雙重作用，因此若將其應(yīng)用作食品添加劑，將具有廣闊的發(fā)展前景。

圖5 不同濃度H2O2對(duì)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of H2O2on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin and sodium iron chlorophyllin

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