孫海燕,付慶云,王朝輝,陳穎

（1.河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科,河南衛(wèi)輝453100）

鬼針草（Bidens bipinnata L.）屬菊科鬼針草屬（Bidens L.）,是以黃酮類為主要活性成分的食藥兩用植物[1].始載于《本草拾遺》,主治心血管疾病、肝炎、急性腎炎等[2-3].研究發(fā)現(xiàn),鬼針草全草總黃酮（total flavones of Bidens bipinnata L.,TFB）是治療小鼠急性肝損傷的有效成分[4-6].但鬼針草TFB在不同生理部位含量及組成差異較大[7-8].鑒于鬼針草不同部位的TFB對急性肝損傷保護作用的研究還未見報道,故本試驗采用正交試驗高效提取鬼針草各部位的TFB,利用CCl4制備急性肝損傷小鼠模型,觀察血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase,AST）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）的變化,以明確其保肝作用及有效部位,旨在為鬼針草的有效開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 昆明小鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量18~20 g,購于新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心,動物使用許可證號SYXK（豫）2010-0042.

1.1.2 藥物與試劑 鬼針草采于河南新鄉(xiāng)鳳凰山,由河南科技學院植物學教研室孟麗教授鑒定；TFB由河南科技學院生物技術(shù)教研室制備；ALT、AST和LDH試劑盒（批號分別為R401BCA,R401B1A,R305ACA）購自上海藍怡科技有限公司；蘆丁標準品（批號A0103）購于成都曼斯特生物科技有限公司；CCl4（批號20120815）購于杭州輝煌化工有限公司.

1.1.3 試驗儀器 AU2700全自動生化分析儀（Olympus）,JA2003H型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）,722H型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）,DK-8A型電熱恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學儀器有限公司）,RE-52c型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限公司）.

1.2 試驗方法

1.2.1 鬼針草總黃酮的提取

標準曲線的繪制：精密稱取蘆丁標準品5.0mg,置100mL容量瓶中,加適量乙醇,使充分溶解,用體積分數(shù)為50%的乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得標準品溶液.分別吸取標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,于10mL容量瓶中,加水至5mL,精密加入質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉試液0.3mL,搖勻.室溫放置6min后加入質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鋁試液0.3mL,搖勻.6min后再加入質(zhì)量分數(shù)為4%的氫氧化鈉溶液2.0mL,加水至刻度.15min后在510 nm（試驗測得的最大吸收波長）處測定吸光度,用空白試劑作參比.以標準品含量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線.標準曲線方程為Y=17.049X-0.003 9,R2=0.999 3,線性范圍：0~0.025mg/L.

鬼針草總黃酮含量的測定：精密量取樣品溶液各0.3mL,其余同“標準曲線的繪制”項中標準品溶液測定方法,計算樣品中總黃酮的含量.

正交試驗優(yōu)選鬼針草總黃酮的提取條件：在單因素試驗的基礎(chǔ)上,確定TFB提取的主要因素和水平（見表1）.精確稱取鬼針草粉末9份,每份5 g,分別加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液100mL,按正交設(shè)計表進行提取.提取液過濾后備用.確定最佳提取工藝后分別提取鬼針草葉、枝和全草的總黃酮并檢測其含量.

表1 因素水平Tab.1 Factorsand levels

1.2.2 分組及給藥 昆明小鼠66只,雌雄各半,隨機分為11組：正常對照組（n=6）,模型組（n=6）及鬼針草治療組（n=54）.其中鬼針草治療組又分為3個亞組：全草總黃酮治療組、葉總黃酮治療組和枝總黃酮治療組,每亞組又分為高劑量（160mg/kg）、中劑量（80mg/kg）和低劑量（40mg/kg）治療組,共 9組（n=6）.昆明小鼠分籠飼養(yǎng),在20~25℃,濕度50%~60%的環(huán)境中自由飲食3 d后進行試驗.正常對照組每天灌胃相同劑量生理鹽水,模型組小鼠每天灌胃相同劑量的乙醇,其余各組分別給予相應(yīng)的受試藥物,每天1次,連續(xù)14 d.末次灌胃后2 h,除正常組外,其余各組分別按10mL/kg的劑量腹腔注射用花生油配成的體積分數(shù)為0.1%的CCl4溶液.禁食24 h后以體積分數(shù)為10%的水合氯醛麻醉,心臟取血分離血清后以IFCC速率法測定ALT、AST和LDH活性.

1.3 檢測指標

末次給藥后取材,IFCC速率法測定ALT、AST和LDH活性,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行.

1.4 統(tǒng)計處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（One-Way ANOVA）和t檢驗,P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 鬼針草總黃酮提取條件最佳優(yōu)化工藝

鬼針草總黃酮提取條件優(yōu)化結(jié)果見表2.

表2 正交試驗提取鬼針草總黃酮Tab.2 Contents of TFB by orthogonal test

根據(jù)表2中極差（R值）可知,各因素對鬼針草總黃酮的影響順序為：乙醇體積分數(shù)＞提取次數(shù)＞提取時間＞提取溫度.鬼針草總黃酮的最佳提取工藝為A1B2C2D3,即在固液比為1∶10,乙醇體積分數(shù)為80%,提取溫度為60℃的條件下提取1 h,提取3次.

2.2 驗證試驗及鬼針草不同部位TFB含量檢測

在最佳條件（A1B2C2D3）下進行提取方法的驗證試驗,提取得總黃酮46.725mg/g,較正交試驗中的最優(yōu)組43.956mg/g含量高,表明此正交試驗得出的最優(yōu)組合符合實際.稱取鬼針草的葉、枝和全草粉末各50 g,在最佳條件（A1B2C2D3）下測定其總黃酮含量,結(jié)果見表3.

表3 鬼針草不同部位總黃酮的含量Tab.3 Contentsof TFB in differentphysiologicalparts

由表3可知,鬼針草不同生理部位總黃酮的含量差異較大,其中葉總黃酮含量最大,其次是全草總黃酮的含量,枝的總黃酮含量最低,約為葉總黃酮含量的1/2.

2.3 鬼針草不同部位TFB對急性肝損傷小鼠ALT的影響

鬼針草不同部位TFB對急性肝損傷小鼠ALT的影響結(jié)果見圖1.

圖1 鬼針草不同部位TFB對小鼠ALT的影響Fig.1 EffectofTFB in differentphysiologicalpartson ALT inmice

由圖1可知,正常組ALT活性較低,模型組ALT活性極顯著高于對照組（P=0.000 0）.鬼針草治療組與正常組相比,除中劑量枝TFB組ALT活性基本維持在正常水平（P=0.349 6）外,其余各組均有極顯著性差異（P＜0.01）.鬼針草治療組低劑量葉TFB、中劑量枝TFB及低劑量全草TFB,ALT的活性極顯著低于模型組（P＜0.01）.其余治療組ALT活性較模型組均呈極顯著的上升趨勢（P＜0.01）.

2.4 鬼針草不同部位TFB對急性肝損傷小鼠AST的影響

鬼針草不同部位TFB對急性肝損傷小鼠AST的影響結(jié)果見圖2.

圖2 鬼針草不同部位TFB對小鼠AST的影響Fig.2 Effect of TFB in different physiological partson ALT in mice

由圖2可知,模型組中AST活性與正常組相比,有統(tǒng)計學差異（P=0.014 9）.與正常組相比,低劑量葉TFB組中AST活性降低（P=0.019）,低劑量全草TFB組與正常組無統(tǒng)計學差異（P=0.452 6）.其余各治療組AST活性均高于正常組,并呈極顯著性差異（P＜0.01）.與模型組相比,僅低劑量葉TFB組中AST活性較模型組降低,并呈極顯著性差異（P=0.002）,其余各治療組AST活性均呈上升趨勢.

2.5 鬼針草不同部位TFB對急性肝損傷小鼠LDH的影響

鬼針草不同部位TFB對急性肝損傷小鼠LDH的影響結(jié)果見圖3.

由圖3可知,與正常組相比,模型組LDH活性升高但無統(tǒng)計學差異（P=0.352 5）,鬼針草治療葉TFB（低、中和高劑量）組、枝TFB高劑量、全草TFB低和中劑量組中LDH的活性均降低,但統(tǒng)計學分析顯示僅有低劑量葉TFB組和低劑量全草TFB組有極顯著性差異（P=0.003 2,P=0.000 8）,其余各組均無統(tǒng)計學意義.與模型組相比,LDH活性極顯著降低的有低劑量葉和全草TFB組（P=0.000 1,P=0.000 0）、中劑量全草TFB組（P=0.003 4）.

3 討論

CCl4肝損傷模型是經(jīng)典的肝損傷模型,CCl4進入肝細胞后,經(jīng)肝微粒體細胞色素P450代謝為CCl3,引起肝微粒體脂質(zhì)過氧化,從而破壞肝細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性,導致肝損傷[9].ALT、AST和LDH是肝內(nèi)主要敏感性標志酶[10],當肝細胞受損時三者在血清中的濃度大大增加,因此檢測血清中ALT、AST和LDH的活性變化能準確地反應(yīng)肝細胞的受損程度.

TFB被普遍用于治療肝臟損傷,但研究發(fā)現(xiàn)TFB在急性肝損傷中的作用并不一致.一些研究發(fā)現(xiàn)TFB對急性肝損傷具有一定的保護作用[6,11-12],但另一些研究結(jié)果卻顯示鬼針草不同生理部位TFB含量差異較大,并且不同部位TFB的體外抗氧化能力也有較大的差異[7-8].為進一步證明不同生理部位TFB的生理作用,本試驗以不同生理部位提取的TFB為材料,初步研究了其在急性肝損傷中的作用.結(jié)果顯示,鬼針草不同生理部位TFB在不同劑量預適應(yīng)后對小鼠急性肝損傷的作用不同.鬼針草葉和全草TFB低劑量時能顯著降低小鼠血清中ALT和LDH活性,具有明顯的急性肝損傷保護作用,而葉和全草TFB高劑量治療組ALT的活性及枝TFB高劑量治療組AST的活性顯著高于模型組,提示可能有一定的肝損傷作用.本試驗結(jié)果提示,在選用TFB進行急性肝損傷治療時,需慎重選擇鬼針草不同生理部位TFB的劑量,葉和全草TFB低劑量治療時的安全性較好.

研究發(fā)現(xiàn)TFB可抑制諸如NF-κB、IL-8、TNF-α及NO等炎性相關(guān)因子的表達及提高SOD和T-AOC活性,抑制脂質(zhì)過氧化[2,6],進而顯著降低小鼠血清中ALT、AST和MDA活性,減輕肝臟的病理損傷程度[4-5].與多個研究小組的結(jié)果相一致,作者前期研究發(fā)現(xiàn)葉和全草TFB低劑量能提高血清中SOD活性,降低MDA和iNOS的表達,進一步提示TFB在鬼針草不同生理部位分布的不均勻性及生理活性的差異,且TFB隨劑量的升高表現(xiàn)出較高的細胞毒性.雖然本研究初步探明了不同生理部位TFB的活性,但有哪些黃酮在肝損傷中起到了積極作用,有待于我們進一步研究.

綜上所述,本試驗初步揭示了鬼針草TFB在治療急性肝損傷中的潛在應(yīng)用價值及活性部位,研究結(jié)果顯示低劑量的葉和全草TFB具有較強的急性肝損傷保護作用,為今后鬼針草TFB活性成分追蹤及闡明其在急性肝損傷治療中的作用機制提供了理論依據(jù).

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