陳旖旎，白文坤，胡兵

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原子力聲顯微鏡的原理及應(yīng)用

陳旖旎，白文坤，胡兵

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海超聲醫(yī)學(xué)研究所，上海 200233)

原子力聲顯微鏡結(jié)合了超聲檢測(cè)技術(shù)的三維成像能力與原子力顯微鏡的納米尺度成像的近場(chǎng)顯微技術(shù)。它在商用的原子力顯微鏡設(shè)備的基礎(chǔ)上加以壓電超聲傳感器產(chǎn)生聲激勵(lì)，并使用鎖相放大器對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集分析，既可得到三維的納米級(jí)的清晰形貌圖，又能通過(guò)建模分析樣品表面的接觸剛度及樣品的彈性模量。目前，原子力顯微鏡被廣泛應(yīng)用于材料領(lǐng)域，用于檢測(cè)樣品的機(jī)械性能，比如樣品的接觸剛度、薄膜高分子材料的彈性模量，同時(shí)還運(yùn)用于醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，用于觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及其表面和亞表面的彈性模量等。

原子力聲顯微鏡；納米圖像；彈性模量；接觸剛度

0 引言

隨著科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域研究不斷深化至微觀領(lǐng)域，用于了解物質(zhì)特性的納米級(jí)超高分辨率的非侵入式空間成像檢測(cè)技術(shù)在生物材料等領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。基于光波、聲波原理的傳統(tǒng)三維成像技術(shù)由于受衍射分辨極限的限制，分辨率通常較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在納米尺度上對(duì)樣品性質(zhì)的精細(xì)觀察分析，直到上世紀(jì)80年代，掃描探針顯微鏡(Scanning Probe Microscope, SPM)的發(fā)明使得人們對(duì)物質(zhì)世界的認(rèn)識(shí)與改造深入到了原于和分子水平。掃描探針顯微鏡(SPM)是采用尖銳的探針在樣品表面掃描，利用探針與樣品間的各種相互作用，探測(cè)樣品表面物理或化學(xué)性質(zhì)的一種顯微鏡，如應(yīng)用最廣泛的原子力顯微鏡；但傳統(tǒng)的SPM無(wú)法探測(cè)樣品表面以下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息和彈性特性，而掃描聲學(xué)顯微鏡(Scanning Acoustic Microscope, SAM)卻彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)。掃描聲學(xué)顯微鏡具有的高頻超聲掃描成像技術(shù)，利用聲透鏡使超聲波在樣品表面及內(nèi)部聚焦，并利用測(cè)量點(diǎn)的散射回波進(jìn)行成像，因而能觀察光學(xué)不透明材料的淺層組織，掃描聲學(xué)顯微鏡所產(chǎn)生的圖像反映了樣品的材料力學(xué)參量，如剛度、粘度、韌度、密度、形貌等；在超聲測(cè)量中，掃描聲學(xué)顯微鏡對(duì)絕大多數(shù)樣品屬無(wú)損檢測(cè)，甚至對(duì)活細(xì)胞也能進(jìn)行無(wú)明顯損害檢驗(yàn)。但是掃描聲學(xué)顯微鏡在檢測(cè)時(shí)需要將被檢測(cè)對(duì)象浸在耦合液(水)中，并且由于其頻率的限制，軸向分辨率只能達(dá)到幾十微米，側(cè)向分辨率甚至只有上百微米，因此同樣不適于埋入或嵌入式納米結(jié)構(gòu)的無(wú)損檢測(cè)?；谏鲜鰞煞N顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)，不斷有科學(xué)家嘗試將此兩種技術(shù)結(jié)合[1]，最終發(fā)明了原子力聲顯微鏡(Atomic Force Acoustic Microscopy, AFAM)。

原子力聲顯微鏡(AFAM)結(jié)合超聲檢測(cè)技術(shù)中的三維成像能力和原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)的納米尺度成像技術(shù)，激勵(lì)原子力顯微鏡的懸臂梁或被測(cè)樣品做超聲振動(dòng)，并精確測(cè)量掃描過(guò)程中懸臂梁振動(dòng)幅值或諧振頻率的偏移，即可反映樣品亞表面缺陷以及表面局域機(jī)械特性，如接觸剛度、彈性模量等[2]。

1 工作原理

原子力顯微鏡(AFM)利用了原子間的范德華力與原子間的距離有一個(gè)確定的函數(shù)關(guān)系這個(gè)特性，去探測(cè)樣品的原子結(jié)構(gòu)和表面情況。針尖與樣品表面之間距離的變化，導(dǎo)致針尖和樣品表面之間的原子力變化。這就引起懸臂梁在垂直方向上發(fā)生振動(dòng)。原子力顯微鏡在懸臂梁上裝有微反射鏡。因此，利用激光束的偏轉(zhuǎn)可檢測(cè)出針尖與樣品表面之間變化的原子力。將激光束的偏轉(zhuǎn)信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)專(zhuān)用軟件中進(jìn)行分析處理，即可得到樣品表面的形態(tài)結(jié)構(gòu)信息。原子力聲顯微鏡(AFAM)是建立在原子力顯微鏡的平臺(tái)上。除基于上述原理之外，同時(shí)運(yùn)用超聲波穿透樣品，由于內(nèi)部嵌入其它材料的信息而使聲波振幅和相位發(fā)生變化。再利用光電檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)其變化，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析得出樣品的信息，結(jié)構(gòu)原理圖如圖1所示。

圖1 原子力聲顯微鏡結(jié)構(gòu)原理圖

1.1 原子力聲顯微鏡分類(lèi)

根據(jù)激勵(lì)的方式可以分為針尖激勵(lì)原子力聲顯微鏡(T-AFAM)、樣品激勵(lì)原子力聲顯微鏡(S- AFAM)和掃描近場(chǎng)超聲全息術(shù)(Mold-Synthesizing Atomic Force Microscopy, MSAFM)。

1.1.1 針尖激勵(lì)原子力聲顯微鏡

T-AFAM是將激勵(lì)信號(hào)輸入到粘貼在懸臂上的壓電傳感器，使微懸臂及其尾端的探針振動(dòng)。當(dāng)針尖接觸樣品表面時(shí)，針尖下方的樣品表面產(chǎn)生形變而激發(fā)聲波，由粘附在樣品背面的壓電傳感器將聲波信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，輸入到以激勵(lì)信號(hào)為參考信號(hào)的鎖相放大器，獲得形貌圖和相位圖。

1.1.2 樣品激勵(lì)原子力聲顯微鏡

S-AFAM的工作方式是指AFM工作在接觸模式，樣品背面用耦合劑粘接壓電傳感器，放置在原子力顯微鏡支架上，將激勵(lì)源接入壓電傳感器[3]。信號(hào)發(fā)生器驅(qū)動(dòng)壓電傳感器產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)的振動(dòng)信號(hào)，信號(hào)穿過(guò)樣品達(dá)到表面后攜帶有包含其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，如力學(xué)特性、尺寸等，再通過(guò)與樣品接觸的懸臂梁探針傳遞到懸臂梁上，由原子力顯微鏡的光電檢測(cè)系統(tǒng)探測(cè)并分析從而得到內(nèi)部結(jié)構(gòu)引起的信號(hào)振幅相位變化，而變量就表征著樣品的結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能[4]。

1.1.3 掃描近場(chǎng)超聲全息術(shù)原子力聲顯微鏡

MSAFM的工作方式是在AFM的基礎(chǔ)上，在樣品下與懸臂梁同時(shí)激勵(lì)兩路超聲波信號(hào)，激勵(lì)頻率均遠(yuǎn)大于懸臂梁的諧振頻率，調(diào)節(jié)兩者的差值使其與懸臂梁的諧振頻率相同，樣品下的超聲振動(dòng)信號(hào)通過(guò)樣品與懸臂梁的超聲振動(dòng)信號(hào)在樣品表面產(chǎn)生駐波，且其駐波頻率與懸臂梁諧振頻率相等。當(dāng)懸臂梁在樣品表面掃描時(shí)，就可檢測(cè)到表面駐波引起的懸臂梁振幅相位變化，而通過(guò)記錄這種變量可獲得樣本內(nèi)部信息。

1.2 低頻激勵(lì)模式

在超聲激勵(lì)模式下，使探針針尖周期性地與樣品接觸，而獲得樣品彈性特性及材料結(jié)構(gòu)特征等[5]。如果樣品可以在以超聲頻率垂直振動(dòng)的同時(shí)，使樣品在低于共振頻率下作水平振動(dòng)，還可獲得表面的摩擦力和表面內(nèi)部的剪切硬度信息。與超聲激勵(lì)模式相同，在低頻激勵(lì)模式下也能獲得樣品的彈性特性、粘滯特性以及摩擦力和剪切硬度。但由于低頻激勵(lì)的頻率要比超聲激勵(lì)的模式低2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，其圖像中的亮度與硬度對(duì)應(yīng)關(guān)系的表現(xiàn)不同。

S-AFAM采用寬帶換能器，因此比較容易產(chǎn)生高強(qiáng)度信號(hào)，對(duì)樣品和針尖的損傷較小，能觀察生物等柔軟樣品，而T-AFAM在測(cè)量過(guò)程中產(chǎn)生摩擦程度較大，一般用來(lái)觀察表面硬度較高的樣品。

考慮到樣品的損壞及設(shè)備的制備難易度，樣品激勵(lì)原子力聲顯微鏡的研究最為廣泛。

2 應(yīng)用

原子力顯微鏡由于其分辨率高、工作范圍寬泛、樣品制備簡(jiǎn)單等因素，廣泛應(yīng)用于測(cè)量樣品在納米數(shù)量級(jí)下的理化性質(zhì)。而由于原子力聲顯微鏡是在原子力顯微鏡基礎(chǔ)上與超聲技術(shù)的結(jié)合，既能利用聲學(xué)顯微鏡的三維成像能力，又可以實(shí)現(xiàn)原子力顯微鏡的納米分辨能力(如圖2所示[6])，同時(shí)還能獲得樣品的彈性特性，摩擦力等，以及對(duì)樣品的接觸硬度的定量測(cè)量，此外還可對(duì)活體細(xì)胞等微生物進(jìn)行成像，被譽(yù)為探針下的實(shí)驗(yàn)室[7]。

圖2 硅表面上的鉑納米島的原子力顯微鏡圖像和硅表面上的鉑納米島的原子力聲顯微鏡圖像

U．Rabe的課題組[8]在1997年提出將原子力聲顯微鏡懸臂梁接觸樣品簡(jiǎn)化為線性的彈性梁．他們建立了懸臂梁與樣品表面接觸或在樣品表面附近時(shí)的模型，可以計(jì)算帶傳感器針尖的懸臂梁振動(dòng)行為，以及從懸臂梁的振動(dòng)信號(hào)中提取出表面彈性特征信息。通過(guò)測(cè)得的懸臂梁各階諧振頻率與波數(shù)，由特征方程求得其接觸剛度，再由赫茲接觸模型就可以分析出樣品的彈性模量。在2000年，Kester等[9]運(yùn)用原子力聲顯微鏡方法對(duì)納米鐵電體晶體薄膜的彈性模量進(jìn)行研究，這個(gè)彈性模量是氧化溫度的函數(shù)，研究給出了隨著氧化溫度的升高，彈性模量的變化趨勢(shì)，顯示在其有一個(gè)最大彈性模量對(duì)應(yīng)的溫度。2002年，U．Rabe等[10]運(yùn)用單晶硅檢測(cè)AFAM對(duì)材料局部機(jī)械性質(zhì)測(cè)量的敏感性，也首次測(cè)得構(gòu)成PIC-151陶瓷的單晶硅的彈性數(shù)據(jù)。U．Rabe等認(rèn)為可以將此技術(shù)運(yùn)用于其他的多相物質(zhì)。他們還運(yùn)用AFAM顯示了鋯鈦酸鉛陶瓷的鐵電體結(jié)構(gòu)圖像，以及對(duì)樣品局部彈性常數(shù)的定量測(cè)量。但是由于懸臂的水平位置也許會(huì)有所偏移，且探針也不一定位于懸臂的正中央，探針的磨損等因素的干擾，其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步提高。在此之后，不斷有研究人員用該技術(shù)對(duì)許多納米復(fù)合材料的彈性模量進(jìn)行測(cè)定[11-14]。

在2008年，Parlak, Zehra等[15]建立了針尖與嵌入內(nèi)部結(jié)構(gòu)的基底接觸的三維有限元分析模型，能夠?qū)υ恿︼@微鏡針尖掃描樣品表面的接觸剛度進(jìn)行模擬，并在原子力聲顯微鏡實(shí)驗(yàn)上對(duì)其結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。此模型還可以用于對(duì)原子力聲顯微鏡亞表面缺陷的成像參數(shù)進(jìn)行分析。張改梅[16]等運(yùn)用原子力聲顯微鏡對(duì)試樣次表面缺陷進(jìn)行分析，超聲幅值成像能反映試樣的彈性性能，如果存在此表面缺陷，此處的彈性模量就會(huì)大大降低，從而此處探針-試樣的接觸剛度也會(huì)降低，接觸諧振頻率也會(huì)有所不同。隨著研究的不斷深入，影響彈性模量定量測(cè)量結(jié)果的因素也受到了不少研究者的關(guān)注。F. Marinello[17]等在其文章中就此問(wèn)題進(jìn)行了討論分析，這些影響因素包括了探針的特性(如懸臂梁的幾何特性、力的持續(xù)性、實(shí)質(zhì)的共振頻率)以及掃描的設(shè)置等。結(jié)果顯示影響彈性模量定量測(cè)量的因素主要為探針及其與樣品表面的相互作用。對(duì)于給定的探針，其幾何及機(jī)械特性相對(duì)穩(wěn)定，只是由于其與樣品表面接觸，不斷有磨損而影響探針的半徑和高度從而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，這就需要及時(shí)觀察或?qū)μ结樳\(yùn)用耐磨材料包被以減少誤差。使用不同探針時(shí)，其結(jié)果的變異性相對(duì)較大，即使用同一批探針，其幾何及機(jī)械特性也相差較大，因此試驗(yàn)時(shí)最好使用同一探針，以保障試驗(yàn)的可靠性。

A. Caro[18]等還運(yùn)用原子力聲顯微鏡研究鎳納米晶體的局部?jī)?nèi)部摩擦力和可塑性，通過(guò)使用原子力聲顯微鏡觀察鎳納米晶體的接觸諧振，他們發(fā)現(xiàn)在多種靜載荷下接觸阻尼Q-1都發(fā)生增加。他們認(rèn)為這種影響是由不均勻的位錯(cuò)成核造成的，且這些變化在卸載時(shí)是可逆的，這是基于這樣的事實(shí)：代表成核的應(yīng)力場(chǎng)的尺寸變得太窄，以至于成核的位錯(cuò)環(huán)不能達(dá)到它的臨界半徑。在他們看來(lái)，有以下幾個(gè)因素影響接觸阻尼：(1) 由于探針內(nèi)諧振彈性場(chǎng)的滯彈性位錯(cuò)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的內(nèi)部摩擦力，類(lèi)似于振動(dòng)弦模型；(2) 在產(chǎn)生位錯(cuò)環(huán)時(shí)的能量損失。接觸阻尼的背景損失可能是由探針變形處的應(yīng)力場(chǎng)與費(fèi)米面的電子分布間相互影響造成的。

由于原子力聲顯微鏡的使用不受樣品導(dǎo)電性的影響，也不需要固定和脫水，能在液體狀態(tài)下對(duì)樣品成像，所以一直受到生物學(xué)家和生物物理學(xué)家的關(guān)注。它不僅能像原子力顯微鏡一樣用于對(duì)細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架及細(xì)胞間相互作用力的研究，如研究細(xì)胞的群集運(yùn)動(dòng)，染色體、染色質(zhì)及DNA的研究等，還可以對(duì)細(xì)胞的彈性狀況進(jìn)行研究。張波[19]等運(yùn)用AFAM對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，得出了形貌像及AFAM像，形貌像中，明亮度高低反映了細(xì)胞表面高度的不同，AFAM的聲激勵(lì)圖中的明亮度反映了細(xì)胞表面及亞表面的彈性度。文章中認(rèn)為細(xì)胞骨架并非惰性結(jié)構(gòu)，而是一種高度動(dòng)態(tài)的組織，細(xì)胞在生理病理變化過(guò)程中，可能伴隨細(xì)胞骨架重排等變化發(fā)生粘彈性變化。這表明可以通過(guò)原子力聲顯微鏡觀察細(xì)胞在不同狀態(tài)下，或經(jīng)過(guò)不同處理后其形貌及內(nèi)部彈性模量的改變，并可了解這些改變對(duì)細(xì)胞的增殖分化的影響。

3 總結(jié)和展望

如今，原子力聲顯微鏡已被廣泛用于材料學(xué)，用于分析聚合物、陶瓷、金屬、半導(dǎo)體等的彈性模量及摩擦力等的定量測(cè)量，同時(shí)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也頗受重視。但由于試驗(yàn)中懸臂梁的形狀、材料以及探針的特性和磨損等因素影響，測(cè)量結(jié)果的精度還有待提高。且由于數(shù)據(jù)量大，分析時(shí)間長(zhǎng)，未能實(shí)時(shí)成像，但隨著研究的不斷深入，相信下一代的原子力聲顯微鏡定能為我們提供實(shí)時(shí)高速高分辨率成像，為材料及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作出巨大貢獻(xiàn)。

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Applicantion and principle of the atomic force acoustic microscopy

CHEN Yi-ni, BAI Wen-kun, HU Bing

(Department of Ultrasound in Medicine, The 6th People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai Institute of Ultrasound in Medicine, Shanghai 200223, China)

Atomic force acoustic microscopy is a near-field technique which combines the ability of ultrasonics to image elastic properties with the high lateral resolution of scanning probe microscopes. The ultrasonic signals are excited by a ultrasonic piezoelectric generator which is added to a commercial AFM.3-D and the high resolution images in nano scale are achieved by the analysis of the lock-in amplifier and the computer. Atomic force acoustic microscopy has been presented to measure the mechanical characterization of the sample, such as contact stiffness，the elastic modulus of the films and also the submicrometre structures of the cell.

Atomic force acoustic microscopy; nanoimage; elastic modulus; contact stiffness

TB556

A

1000-3630(2014)-06-0508-04

10.3969/j.issn1000-3630.2014.06.006

2013-10-15;

2013-12-11

陳旖旎(1989－), 女, 福建建甌人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)樵恿β曪@微鏡的應(yīng)用。

胡兵, E-mail: binghuzz@263.net