包建民，高赫男，王琨，李優(yōu)鑫

(天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

固相萃取技術(shù)(SPE)是利用目標(biāo)成分與其它成分在固定相上保留方式和能力的不同，達(dá)到分離、富集、純化的目的。主要優(yōu)點(diǎn)是能處理低濃度試樣;操作簡(jiǎn)單快速，便于自動(dòng)化;分離時(shí)間短;富集倍數(shù)高;有機(jī)溶劑的低消耗;方便試樣的儲(chǔ)存和運(yùn)送等［1］。在環(huán)境、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域［2-5］，逐漸取代傳統(tǒng)方法，獲得廣泛應(yīng)用。目前，在美國(guó)、歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家，SPE已被列入行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［6-9］，基本取代傳統(tǒng)的預(yù)處理方法。

中藥制劑劑型多樣、樣品成分復(fù)雜、有效成分含量低、雜質(zhì)較多，使得中藥制劑的含量測(cè)定存在干擾多、方法專屬性和重復(fù)性不佳等問題，同時(shí)，容易污染儀器，降低儀器的使用壽命。因此，中藥制劑的預(yù)處理技術(shù)一直是中藥研究的重要內(nèi)容之一。

本文選取藥典［10］收載的采用液-液萃取預(yù)處理方法的復(fù)方草珊瑚含片作為研究對(duì)象，在藥典方法基礎(chǔ)上，建立基于SPE預(yù)處理技術(shù)的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察。通過(guò)與藥典方法的比較，評(píng)價(jià)SPE技術(shù)用于此藥品預(yù)處理的實(shí)用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

異嗪皮啶標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110837-200304);江中牌復(fù)方草珊瑚含片(生產(chǎn)批號(hào)0512018);甲醇、乙腈均為色譜純;蒸餾水。

Waters 600s型高效液相色譜儀(包括616型泵，717型自動(dòng)進(jìn)樣器，486型紫外檢測(cè)器);DL-180A超聲清洗器;AL-104電子分析天平;SPE-C18小柱。

1.2 色譜條件

色譜柱 Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1% 磷酸水溶液(12.5∶87.5)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，柱溫室溫，進(jìn)樣量 20 μL。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇，制成38 μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)一步稀釋，得一系列濃度的對(duì)照品溶液。

1.4 樣品液的配制

1.4.1 藥典法 按照2005年版中國(guó)藥典規(guī)定方法進(jìn)行處理。取本品10片，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，加水約10 mL，超聲處理(功率300 W，頻率25 kHz)10 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取5次，每次10 mL，離心收集合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

1.4.2 SPE 法

1.4.2.1 提取 復(fù)方草珊瑚含片研磨，過(guò)7#篩。精密稱取粉末0.80 g，精密加水8 mL，超聲處理30 min，離心3 min，轉(zhuǎn)速11 000 r/min，合并上清液。

1.4.2.2 固相萃取 取上清液1.0 mL，過(guò) SPE 柱(經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水洗)用 10 mL水淋洗、5 mL 10%甲醇淋洗，以5 mL 50%甲醇洗脫，收集洗脫液，定容至 5.0 mL。經(jīng) 0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，濾液進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)及色譜條件優(yōu)化

根據(jù)分離度和保留時(shí)間，優(yōu)化流動(dòng)相中磷酸和乙腈的濃度，確定流動(dòng)相為乙睛∶0.1%磷酸=12.5∶87.5。

取樣品液，按1.2節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣4次，色譜圖見圖 1，考察理論塔板數(shù)為34 000 塊/m，拖尾因子0.97，分離度為 2.4，RSD 為0.6%。處理后得到的樣品雜質(zhì)成分簡(jiǎn)單，有效成分含量高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard and sample after SPE treatment

2.2 SPE洗脫條件優(yōu)化

按1.4.2節(jié)處理樣品，分別用5 mL不同濃度的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集水洗液和洗脫液，優(yōu)化洗脫條件。結(jié)果表明，5%，10%甲醇洗脫液中都檢測(cè)不到異嗪皮啶的色譜峰，15% ～50%甲醇洗脫液中都能檢測(cè)到異嗪皮啶譜峰。因此，采用將樣品通過(guò)活化的 SPE小柱后，依次用10 mL水和5 mL 10%甲醇淋洗，最后用5 mL 50%甲醇洗脫，定容至5 mL進(jìn)行HPLC分析。

為了讓異嗪皮啶盡可能完全保留在SPE柱上，且便于操作，同時(shí)又不使所得溶液濃度過(guò)稀，影響檢測(cè)，故上樣1 mL。為了保證異嗪皮啶完全洗脫下來(lái)，并且為了換算方便，選用5 mL 50%甲醇洗脫。

2.3 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)藥典方法，常溫下10 mL水超聲提取，且超聲過(guò)程中溫度會(huì)升高，故不再考慮提取溫度和提取溶劑的影響，研磨后過(guò)7#篩，消除粒徑的影響。所以本文著重考慮提取時(shí)間的影響。

按1.4.2 節(jié)處理樣品，分別超聲處理 10，15，20，30 min，記錄峰面積，根據(jù)提取的效果以及穩(wěn)定性，超聲30 min結(jié)果最佳，故選用超聲時(shí)間為30 min。

2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋得 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0 μg/mL 一系列濃度的溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，異嗪皮啶濃度為橫坐標(biāo)作圖，擬合回歸得回歸方程y=68 666x－7 046.1，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 6，線性范圍0.5 ～8.0 μg/mL。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

2.5.1 重復(fù)性 取藥典方法和SPE法制得的樣品液，分別進(jìn)樣20 μL，重復(fù)3次，計(jì)算異嗪皮啶含量和日內(nèi)RSD(見表1)，SPE法日內(nèi)精密度優(yōu)于藥典方法。

2.5.2 日間精密度 分別于第1，3，5 d重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，計(jì)算日間RSD，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性符合分析要求。

由表1可知，藥典方法測(cè)得的異嗪皮啶含量略小于SPE方法，主要原因是藥典方法在樣品超聲處理后將混合物多次萃取處理，難免造成異嗪皮啶的損失;而SPE方法在樣品超聲處理后直接離心，上樣，沒有進(jìn)行反復(fù)萃取處理，故減少了異嗪皮啶的損失。

表1 藥典方法和SPE方法的精密度Table 1 Precision of pharmacopoeia method and SPE method

2.6 回收率

2.6.1 絕對(duì)回收率 取1.96 μg/mL的對(duì)照品，按1.4.2.2節(jié)處理，記錄峰面積，重復(fù) 3次，計(jì)算絕對(duì)回收率為99.6%，表明所用SPE柱符合要求。

2.6.2 加樣回收率 按1.4.2.1節(jié)處理樣品，分別精密加入對(duì)照品適量，按1.4.2.2節(jié)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 異嗪皮啶的加樣回收率Table 2 Recoveries of isofraxidin

由表2可知，平均加樣回收率在96.1% ～101.1%，表明分析方法準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

將固相萃取方法應(yīng)用到中藥復(fù)方制劑的前處理中，建立了基于固相萃取的復(fù)方草珊瑚含片含量測(cè)定方法，該方法分析準(zhǔn)確、重復(fù)性好、系統(tǒng)適應(yīng)性高、除雜干凈、對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的污染少、與藥典方法比較，操作簡(jiǎn)便快捷，避免了重復(fù)提取和高毒性有機(jī)溶劑氯仿的使用，整個(gè)前處理過(guò)程中所用有機(jī)溶劑少，環(huán)境友好。

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［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:533.