張夢怡,鄭恒,陳鷹,陳建華

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學,武漢 430065;3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部,武漢 430030;4.武漢凱泰新生物技術有限公司,武漢 430074)

多肽P161聯(lián)合順鉑對多種腫瘤細胞增殖的抑制作用*

張夢怡1,2,鄭恒3,陳鷹1,陳建華4

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學,武漢 430065;3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部,武漢 430030;4.武漢凱泰新生物技術有限公司,武漢 430074)

目的 體外檢測多肽P161聯(lián)合順鉑(DDP)對多種腫瘤細胞增殖的抑制效應。方法采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度DDP、P161單用及聯(lián)合用藥對人肝癌HepG2、人結腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782的生長抑制率。結果DDP和P161對多種腫瘤細胞均有劑量依賴性的抗增殖作用。聯(lián)合給藥組表現(xiàn)為協(xié)同效應,與DDP組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),在相同的抑癌效果下可降低DDP的使用量。且在相同濃度梯度下,聯(lián)合用藥組對Panc-1的抑制效果較差,而對MA-782效果最好。結論P161可以促進腫瘤細胞對DDP的敏感性,二者聯(lián)合用藥可降低DDP有效治療濃度。

順鉑;多肽;抗腫瘤

20世紀80年代,人們發(fā)現(xiàn)一些肽能增加化療藥物的敏感性并且低毒,在維持相同化學治療(化療)療效的同時能夠減少化療藥物的劑量,繼而降低毒副作用。G3BP是一種RasGAP SH3結構域段特異性結合蛋白,且在多種腫瘤組織和細胞中過量表達[1]。據(jù)此,本課題組合成得到一系列RasGAP SH3域段小多肽,分別研究它們的抗腫瘤活性,從中篩選到一個具有很強抑癌活性的多肽RasP161,定名為P161。前期研究證明,多肽P161能夠增強鉑類化療藥物抗結腸癌HCT116的活性[2-3]。為進一步評價P161的抗腫瘤活性,筆者選取人肝癌HepG2、人結腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782為研究對象,采用四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法初步檢測P161聯(lián)合順鉑對上述5種癌細胞增殖的影響,為擴大其基礎研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實驗器材 RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司,批號:NYA0785);0.25%胰蛋白酶、MTT試劑(Sigma公司,進口分裝);順鉑(cisplatin, DDP,德州德藥制藥有限公司,批號:121102);二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,Amerisco公司,批號:120213);胎牛血清(杭州四季青公司,批號:120112); ELx800多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司);人肝癌HepG2、人結腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782來源于武漢大學典型細胞庫。

1.2 P161的合成 多肽P161純度＞95%,相對分子質(zhì)量為3 636.32。由武漢凱泰新生物技術有限公司利用氨基酸殘基,運用芴甲氧羰基方法合成,高效液相色譜(HPLC)法純化及分光儀檢測,并保存于-20℃條件[4]。

1.3 受試藥物的配制 多肽P161用去離子水配制成10 mmol·L-1的母液,篩孔內(nèi)徑0.22 μm的一次性濾頭濾過后,置于-20℃下長期保存。

1.4 細胞抑制率的測定 取對數(shù)生長期的HepG2、HT29、IE8、Panc-1及MA-782細胞,進行消化離心,制成濃度為2.0×104個·mL-1的單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL。設不加細胞的空白對照組、陰性對照組(加入等體積的RPMI1640完全培養(yǎng)液)、DDP組、P161組及聯(lián)合給藥組(DDP+P161),每組均設3個復孔,放入5%二氧化碳(CO2)、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞貼壁24 h后,各實驗組分別加入不同濃度的干預藥物。使得DDP組的終濃度為5,10,20, 40,80 μmol·L-1;P161組終濃度為5,10,20,40, 80 μmol·L-1;聯(lián)合用藥組終濃度為5+20、10+20、20+ 20、40+20、80+20 μmol·L-1,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后取出培養(yǎng)板棄孔內(nèi)液體,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液,加DMSO 150 μL振蕩10 min,使結晶物充分融解。用酶標儀在波長570 nm處測定各孔吸光度(A)值,并用空白對照組調(diào)零。每組實驗重復操作5次,取其平均值。按下列公式計算細胞抑制率(IR),IR(%)= (1-實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0版軟件進行統(tǒng)計分析,結果用均數(shù)±標準差(±s)表示,多個樣本之間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

DDP單用組,高濃度抑制率大于低濃度,呈明顯的劑量依賴關系,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。單用P161,除Panc-1細胞外,均有較好抑制效果,抑制率隨其濃度增加而增加,呈明顯的劑量依賴關系,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對IE8、HT29和MA-782細胞,單用P161在濃度＞40 μmol·L-1時,對腫瘤細胞的抑制率高于單用DDP組。聯(lián)合給藥組抑制率隨DDP濃度增加而增加。在DDP濃度一定的條件下,對不同腫瘤細胞增殖的抑制率高于單用DDP組(P＜0.05)。除HT29細胞外,聯(lián)合給藥組在DDP用量為20 μmol·L-1時,對腫瘤的抑制效果就可達到單用DDP 80 μmol·L-1時腫瘤抑制效果。在相同濃度梯度下,聯(lián)合用藥組對Panc-1的抑制率明顯低于其余4種細胞組(P＜0.01),而對MA-782抑制率最高。見表1。

3 討論

針對癌癥的治療,臨床主要采取手術切除、放射治療(放療)、化學治療(化療)以及靶向治療的方式。其中,化療在癌癥的治療中占重要地位。理想的化療是對腫瘤細胞有選擇性的殺傷,而對正常細胞無明顯毒性,由于癌細胞與人正常組織細胞間缺乏根本性的代謝差異,使大部分化療藥物的選擇性較差,毒副作用明顯,治療效果不盡如人意,非特異性化療藥物順鉑就是其中之一。前期證實G3BP與腫瘤細胞的多種生物學特性相關,是一種腫瘤標志物[5],因此筆者首次模擬并證實了G3BP的三維立體結構。基于該蛋白與其結合蛋白RasGAP的相互作用模式,運用分子動力學原理設計獲得了一系列具特異性抗腫瘤活性的多肽,并結合多肽合成、細胞生物檢測方法,設計合成并篩選出最具活性的抗腫瘤肽段。多肽P161就是以上述事實為基礎合理設計篩選出來的。初期,王軍等[6]對人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細胞進行相關研究,發(fā)現(xiàn)RasGAP SH3域段小多肽聯(lián)合順鉑與單用順鉑對HUVEC細胞生長抑制率差異無統(tǒng)計學意義,說明其對人正常對照組織細胞毒副作用較小。

本研究結果顯示,在設定藥物濃度下,單用DDP和P161對腫瘤細胞均有一定的增殖抑制作用,且隨藥物濃度的增加,兩種藥物抑制腫瘤細胞增殖的效果也越明顯,均呈明顯的劑量依賴關系,但二者對不同癌細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義。聯(lián)合給藥組對不同腫瘤細胞的抑制率明顯高于相同濃度下的DDP組,說明P161很有可能是一種潛在的化療藥物增敏劑。值得注意的是聯(lián)合給藥組在保證抗腫瘤活性不變的前提下,減少鉑類用藥劑量,導致化療毒性的減弱,因此有可能整體改善化療的效果。此外,本實驗還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥組對Panc-1的抑制作用最差,較其他4組比較差異有統(tǒng)計學意義。對MA-782的抑制作用最好。除實驗誤差外,可能與G3BP在乳腺癌、前列腺癌和結腸腺癌等腫瘤組織和細胞中過量表達有關[7-8]。

表1 不同濃度DDP和P161單用或聯(lián)合使用對5類腫瘤細胞的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of different concentration of DDP and P161 alone or jointly on five kinds of tumor cell lines %,±s

表1 不同濃度DDP和P161單用或聯(lián)合使用對5類腫瘤細胞的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of different concentration of DDP and P161 alone or jointly on five kinds of tumor cell lines %,±s

與DDP組同一濃度比較,*1P＜0.05;與其他腫瘤細胞比較,*2P＜0.01Compared with DDP at the same concentration,*1P＜0.05;compared with other tumor cell lines,*2P＜0.01

Panc-1MA-782 DDP組56.23±1.438.96±1.258.35±1.579.44±0.5519組別藥物濃度/ (μmol·L-1)IE8HT29HepG2.67±1.65 108.95±1.6214.46±2.1012.81±1.5913.75±1.0028.87±0.40 2018.55±2.6026.68±0.9716.55±0.9616.72±1.1037.70±1.82 4021.04±2.4433.89±2.7735.18±8.0919.95±0.7849.07±0.69 8031.88±2.0943.92±1.4344.55±0.8824.77±0.7851.39±0.77 P161組53.97±1.153.80±1.057.19±1.723.74±0.8123.70±0.67 107.17±1.068.16±1.1114.53±1.378.89±1.5526.91±0.45 2017.15±1.7116.28±1.3617.32±1.3311.91±0.7136.13±0.93 4024.00±2.1836.57±1.1019.27±0.8314.63±0.6951.06±1.32 8039.91±2.3450.08±2.2232.32±8.8916.19±1.3063.67±4.08 DDP+P161組5+2023.24±2.03*117.90±2.35*117.73±1.36*113.99±1.13*1*239.49±1.15*110+2031.47±2.59*121.71±1.12*127.21±1.30*117.40±1.15*1*241.90±0.63*120+2038.53±2.17*128.88±0.89*141.51±1.21*124.22±1.66*1*259.45±0.39*140+2053.16±1.33*141.49±1.37*148.13±0.99*125.48±1.05*1*278.35±0.46*180+2075.99±2.19*159.23±0.56*151.61±2.30*128.01±0.62*1*286.54±1.23*1

綜上所述,相比于P161和DDP單用,兩藥聯(lián)合能提高腫瘤抑制率,但其與順鉑聯(lián)用時引起細胞凋亡、發(fā)揮協(xié)同作用的具體作用機制尚不清楚,有待在整體動物的抗腫瘤藥效和機制中進行進一步的確證。

[1] 張夢怡,陳鷹,陳建華,等.多肽P161聯(lián)合順鉑對乳腺癌MA-782細胞株增殖和凋亡的影響[J].中國藥師,2013, 16(12):1768-1771.

[2] ZHANG H,ZHANG S H,HE H,et al.P161 targets and downregulates G3BP to suppress cell growth and potentiate cisplaitin-mediated cytotoxicity to colon carcinoma HCT116 cells[J].Cancer Sci,2012,103(10):1848-1856.

[3] 張浩.以G3BP為潛在靶點的新型抗腫瘤藥物研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學院,2012:84-86.

[4] 陳建華,黃毅,熊駿宇,等.治療或預防癌癥的多肽或衍生產(chǎn)品及其應用:中國,200910163852.1[P].2009-08-11.

[5] 張浩,邵榮光.G3BP:一種潛在的腫瘤治療靶點[J].藥學學報,2010,45(8):945-951.

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[8] GUITARD E,PARKER F,MILLON R,et al.G3BP is overexpressed in human tumors and promotes S phase entry[J]. Cancer Lett,2001,162(2):213-221.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.008

Inhibitory Effect of Polypeptide P161 Combined with Cisplatin on Proliferation of Multiple Cancer Cells

ZHANG Meng-yi1,2,ZHENG Heng3,CHEN Ying1,CHEN Jian-hua4
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,China;2.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;3.Department of Pharmacy,Tongji Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;4.Wuhan Katy Gen Pharmaceuticals, Inc.,Wuhan 430074,China)

ObjectiveIn vitrodetection of anti-proliferative effects of P161 combined with cisplatin(DDP)on multiple cancer cells.MethodsGrowth inhibition rates of HepG2,HT29,IE8,Panc-1 and MA-782 treated by different concentrations of DDP,P161 and P161 combined with DDP were determined by MTT assay.ResultsDDP and P161 dosedependently inhibited proliferation of multiple tumor cells.A synergistic effect was found in DDP combined with P161 and there was a significant difference in the effect between DDP combined with P161 and DDP alone(P＜0.05).DDP dose could be decreased to reach the same inhibitory effect.In the same concentration gradient of DDP combined with P161,the inhibition rate of Panc-1 was low and that of MA-782 was high.ConclusionP161 can increase the sensitivity of tumor cells to DDP.The combination of P161 and DDP can reduce the effective therapeutic concentration of DDP.

Cisplatin;Polypeptide;Anticancer

R979.1;R965

A

1004-0781(2014)10-1288-03

2013-07-30

2014-03-23

*湖北省自然科學基金資助項目(2011CDB541)

張夢怡(1989-),女,湖北武漢人,藥師,在讀碩士,研究方向:腫瘤藥理學。電話:(0)13207146089,E-mail:zmy422335@hotmail.com。

陳鷹(1971-),女,湖北武漢人,副主任藥師,碩士生導師,博士,研究方向:生物藥劑學。電話:027-87649309, E-mail:cy9262005@yahoo.com.cn。

陳建華(1965-),男,教授,博士,研究方向:生物化學與制藥。電話:027-87690083,E-mail:jeff5ch@163.com。