牛 茜，田雅欄，吳明生

（1.北京市種子管理站，北京 100088；2.北京市農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

SSR分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜品種純度快速鑒定中的應(yīng)用研究

牛 茜1，田雅欄2，吳明生1

（1.北京市種子管理站，北京 100088；2.北京市農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

根據(jù)雜交種帶型雙親互補(bǔ)的原則，從10對(duì)西瓜SSR引物中篩選出適合北京市主栽西瓜品種純度鑒定引物，其中品種京欣1號(hào)和京欣3號(hào)可鑒定的引物最多，均達(dá)到6對(duì)；京秀和航興天秀1號(hào)可鑒定引物最少，只有兩對(duì)。結(jié)合西瓜種仁DNA快速提取方法，利用篩選的引物對(duì)已知純度樣品進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示SSR標(biāo)記能準(zhǔn)確鑒定樣品中混雜的親本種子，可用于西瓜雜交品種純度快速鑒定。

西瓜；品種純度；SSR；快速鑒定

西瓜是北京市主要農(nóng)作物，也是京郊農(nóng)業(yè)大力發(fā)展的特色經(jīng)濟(jì)作物之一，在北京常年種植面積達(dá)1萬hm2，因此保障西瓜種子質(zhì)量對(duì)京郊農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。種子純度作為衡量種子質(zhì)量的4項(xiàng)重要指標(biāo)之一，由于缺乏有效快速的室內(nèi)檢測(cè)方法，在質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中很少開展西瓜種子純度鑒定，這也間接影響著西瓜種子質(zhì)量的提高。

近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記鑒定農(nóng)作物種子純度成為可能，目前在玉米[1]、水稻[2]等一些作物上取得很好效果，這也為西瓜種子純度快速鑒定提供了新的途徑。本文針對(duì)北京市目前主栽的7個(gè)西瓜品種，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選了可以進(jìn)行純度鑒定的引物，同時(shí)利用篩選的引物對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了純度室內(nèi)快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

京欣1號(hào)、京欣2號(hào)、京欣3號(hào)、京欣無籽1號(hào)、京秀、暑寶和航興天秀1號(hào)7個(gè)西瓜品種及其親本材料，均取自北京市審定農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)樣品庫。

1.2 生化試劑

植物新型基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司，PCR所用的10對(duì)SSR引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其余試劑由北京化學(xué)試劑公司提供。

1.3 DNA提取

采用熱堿法快速提取。種子去殼后，將種仁放進(jìn)深孔板中，向每個(gè)孔加入150 μL NaOH溶液（0.1 M），蓋膜后將深孔板放在桌面上水平來回?fù)u晃10下，把深孔板放在沸水浴中加熱5 min后加入150 mL Tris-HCl溶液(10 mM、pH2.0)，水平來回?fù)u晃10下，上清液即可作為DNA模板用于擴(kuò)增。

1.4 SSR-PCR

PCR 擴(kuò) 增 體 系 包 括 MgCl22.5 mol/L、dNTPs 0.15 mol/L、引物0.25 μmol/L、Taq聚合酶0.1U、1×Taq Buffer、基因組DNA 1μL，補(bǔ)水至總體積為10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR儀 (Mastercycler nexus X1)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序：94℃5 min；94℃30 s，60℃35 s，72℃45 s，38個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用4.5%變性聚丙烯酰胺或3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果分析

2.1 引物篩選

采用10對(duì)SSR引物（序列信息見表1）對(duì)7個(gè)西瓜雜交品種組合進(jìn)行篩選，依據(jù)雜交種帶型雙親互補(bǔ)的原則 （如圖1），7個(gè)西瓜品種都篩選出適合其純度鑒定的引物（見表2），其中京欣1號(hào)和京欣3號(hào)的可鑒定引物最多，達(dá)到6對(duì)；其次是暑寶，有5對(duì)引物可以鑒定；京秀和航興天秀1號(hào)可鑒定引物最少，只有兩對(duì)。

10對(duì)引物中，不同的引物鑒定品種純度的能力差異較大，其中引物BVWS01843和BVWS00209能鑒定的品種最多，可以用于5個(gè)品種的鑒定，而引物BVWS00048和BVWS00333可鑒定的品種最少，均為1個(gè)。

圖1 引物“BVWS00297”篩選的結(jié)果

表1 10對(duì)SSR引物序列信息

表2 西瓜品種純度鑒定引物表

2.2 純度鑒定

在京欣1號(hào)40粒雜交種樣品中摻入4粒父本和4粒母本，獲得已知純度的待測(cè)樣品。采用熱堿法提取西瓜單粒種子DNA，用互補(bǔ)帶片段大小差異較大的引物BVWS01843對(duì)該樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示該引物，能準(zhǔn)確檢測(cè)出摻入的4粒父本和4粒母本種子（如圖2），檢出率達(dá)到100%，與實(shí)際相符，說明篩選的引物可有效鑒別西瓜雜交種與親本，適合西瓜品種純度快速檢測(cè)。

圖2 利用引物BVWS01843對(duì)京欣1號(hào)樣品純度檢測(cè)結(jié)果（♂：父本，♀：母本）

3 討論

種子純度是種子質(zhì)量重要指標(biāo)之一，有效的純度檢測(cè)方法將大大提高種子純度檢測(cè)的效率，對(duì)種子質(zhì)量的進(jìn)一步提高具有重要意義。

目前西瓜種子室內(nèi)純度檢測(cè)方法主要還是蛋白電泳法，但是該方法并不適合所有品種，而且電泳受環(huán)境影響大，技術(shù)穩(wěn)定性不是很高。

本研究根據(jù)雙親互補(bǔ)原則，篩選出適合北京地區(qū)主栽西瓜雜交品種純度鑒定引物，可準(zhǔn)確鑒定出樣品中混雜的親本材料。另外，結(jié)合西瓜種仁DNA快速提取方法，可以大大縮短DNA提取時(shí)間，實(shí)現(xiàn)純度樣品的快速、高效鑒定。

目前單引物鑒定一般適合鑒定樣品中親本材料的污染。如果要鑒定異品種，就需要增加鑒定的引物數(shù)量，而相應(yīng)檢測(cè)工作量就會(huì)成倍增加，因此，下一步將通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立多重引物的擴(kuò)增體系，從而提高純度檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。

[1]王鳳格，趙久然，郭景倫，等.適于玉米雜交種純度鑒定的SSR核心引物的確定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15（6）：964-969.

[2]李召華，朱克永，陳祖武，等.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].雜交水稻，2006，21(4)：11-14，47.

1005-2690（2014）07-0037-02

S511

B

2014-05-15

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（D131100000413001）。