陳通威，趙 鵬(山西康寶生物制品股份有限公司，長治 046011;通訊作者，E-mail:ctw001@126.com)

細胞生物學、免疫學以及分子生物學是現(xiàn)代生物學三大前沿學科，細胞培養(yǎng)技術是細胞生物學研究領域中最常用的方法之一。尤其是在生物醫(yī)藥領域，許多基因工程藥物、疫苗等都離不開最基本的細胞培養(yǎng)技術，人二倍體細胞系的建立使人用疫苗得到了長足的發(fā)展［1］。目前，人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)被國內(nèi)外很多科研單位和細胞培養(yǎng)工作者使用［2，3］。

在體外培養(yǎng)細胞時，培養(yǎng)液的pH值過高或過低均會對細胞生長產(chǎn)生不利影響。戴永祥等曾經(jīng)報道過 MRC-5 生長適宜的 pH 值為 7.4［4］，本文對MRC-5的生長pH值范圍進行了擴展研究，找出了適宜MRC-5細胞生長的最佳pH值范圍。在細胞培養(yǎng)過程中，細胞代謝產(chǎn)物的積累會改變培養(yǎng)液的pH值，故常用緩沖液或二氧化碳調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)液pH值，本文使用7.5%的碳酸氫鈉溶液來調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)液的pH值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)，購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，經(jīng)自行建庫后備用，51萬個/ml。

1.1.2 主要設備、器材與試劑 生化培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。pH計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。倒置顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司。超凈工作臺，北京西泰科隆儀器技術有限公司。數(shù)顯恒溫三用水箱，金壇科興儀器廠。高溫電子滅菌爐，SANYO。高壓蒸汽滅菌器，SANYO。滲透儀，WESCOR。T25細胞培養(yǎng)瓶，Nucn。細胞計數(shù)板，玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠。

硫酸慶大霉素，4萬 U/ml，天津藥業(yè)。MEM，0.95%，GIBCO。胎牛血清，民海生物。谷氨酰胺，高級純，Amresco;配置成0.2 mol/L溶液。胰酶，1∶250，BD;配置成 0.25%溶液。NaHCO3，AR，國藥集團;配置成7.5%溶液。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)液配制 MEM細胞培養(yǎng)液的配制:MEM 935 ml，胎牛血清 50 ml，谷氨酰胺 10 ml，慶大霉素5 ml。將上述溶液分成10份，每份100 ml，取9份，分別滴加不同體積的7.5%NaHCO3調(diào)節(jié) pH 值，使培養(yǎng)液的 pH 值分別為 6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6。

1.2.2 細胞復蘇與培養(yǎng) 將配制好的不同pH值細胞培養(yǎng)液各10 ml，加到T25培養(yǎng)瓶中。從液氮中取出凍存的細胞，迅速在37.0℃水浴箱中融化，取適量，分別加入裝有不同pH值培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，輕微搖勻，放置在37.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換細胞培養(yǎng)液，以去除細胞凍存液里的二甲基亞砜(DMSO)，之后繼續(xù)放37.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 觀察細胞形態(tài)變化 每天用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度、增殖速度等，并拍照記錄，直至細胞長成致密單層為止。

1.2.4 細胞計數(shù) 在同一生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)96 h后，取出培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)液，加入適量的0.25%胰酶消化液，消化半分鐘后倒掉胰酶消化液，作用約5 min直至細胞松散脫落，加入10 ml培養(yǎng)液吹打細胞至分散，制成細胞懸液。顯微鏡下觀察不同pH值培養(yǎng)液中的細胞形態(tài)，并用細胞計數(shù)板對細胞數(shù)量進行計數(shù)統(tǒng)計。

細胞計數(shù)公式:1 ml細胞數(shù)=n個方格細胞數(shù)之和×稀釋倍數(shù)×10 000/n，計算出不同pH值培養(yǎng)液中每毫升的細胞數(shù)。

2 結果

2.1 不同pH值培養(yǎng)液對細胞形態(tài)的影響

取出培養(yǎng)的細胞并置于倒置顯微鏡下進行形態(tài)觀察，可見當培養(yǎng)液的pH值＜7.0時，MRC-5生長分裂速度緩慢，顯微鏡下細胞為圓球形，懸浮在培養(yǎng)液中(圖1A);當培養(yǎng)液的pH值在7.0－7.1之間時，細胞形態(tài)與培養(yǎng)液pH值為7.2－7.3所培養(yǎng)的細胞形態(tài)相仿，唯一的區(qū)別是細胞分裂生長速度稍慢(圖1B);當培養(yǎng)液的pH值在7.2－7.3之間時，MRC-5細胞分裂較快，增殖速度迅速，細胞形態(tài)良好，細胞均勻，呈典型的單一梭形外觀，形成細胞群落(圖1C);當培養(yǎng)液的pH值＞7.4時，MRC-5細胞逐漸停止分裂生長，細胞形態(tài)肥大、邊緣不規(guī)則，且有部分細胞破碎(圖1D)。

圖1 不同pH值對細胞生長形態(tài)的影響Figure 1 Effect of pH on the morphology of MRC-5 cells

2.2 不同pH值培養(yǎng)液對細胞數(shù)量的影響

培養(yǎng)96 h后，分別對在pH值為6.8－7.6的培養(yǎng)液中生長的細胞進行計數(shù)，結果見表1。表1數(shù)據(jù)顯示，當培養(yǎng)液的pH值＜7.0時，MRC-5細胞數(shù)目較低;當培養(yǎng)液的 pH值在7.0－7.1之間時，細胞數(shù)目相對增加;當培養(yǎng)液的pH值在7.2－7.3之間時，MRC-5細胞數(shù)目明顯增多，且最高可達2.37×106/ml;當培養(yǎng)液的 pH 值 ＞7.4 時，MRC-5細胞數(shù)目明顯降低，可見部分細胞破碎。

3 討論

細胞培養(yǎng)對于基因工程藥物和疫苗的實驗室研究和工業(yè)化生產(chǎn)非常重要，而細胞生長的微環(huán)境對細胞的影響極大。細胞在體外培養(yǎng)，人們可以有計劃、有選擇、有目標地控制細胞生長的環(huán)境，從而可以研究某些特殊條件下的細胞生物學行為。確立細胞培養(yǎng)條件，需要在培養(yǎng)溫度、血清濃度、培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)液pH值及培養(yǎng)液滲透壓等方面進行反復實驗。其中pH值對細胞行為的影響最大，也最為關鍵，對細胞工業(yè)化生產(chǎn)起著至關重要的作用［1］。

表1 pH對細胞數(shù)量的影響 (n=3)Table 1 Effect of pH on cell number of MRC-5 (n=3)

人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)作為國際認可的人二倍體細胞標準株，因用其生產(chǎn)出的生物制品無外源因子、無外源性細胞殘余DNA和無致瘤性。李亞東等報道，在顯微鏡下觀察，MRC-5細胞呈單一梭形，細胞均勻［5］。本文用不同pH值的培養(yǎng)液培養(yǎng)MRC-5細胞，經(jīng)顯微鏡觀察，分別從細胞形態(tài)變化和細胞數(shù)量統(tǒng)計兩個方面進行了分析研究，旨在確定MRC-5細胞生長的最佳pH值范圍。

實驗結果表明，當培養(yǎng)液的 pH值 ＜7.0時，MRC-5細胞生長緩慢，形態(tài)也不規(guī)則;當培養(yǎng)液的pH值在7.0－7.1之間時，細胞的分裂生長速度有所提高，形態(tài)也變得規(guī)則;當培養(yǎng)液的pH值范圍為7.2－7.3時，最適合 MRC-5生長，細胞形態(tài)規(guī)則，狀態(tài)良好，且增殖速度最快;當培養(yǎng)液的pH值＞7.4時，細胞生長速度變得很慢，甚至停止分裂生長，部分細胞破碎、變形。

通過實驗還可以看出，MRC-5細胞對pH值＞7.4的堿性培養(yǎng)液較敏感，細胞變形嚴重;而對pH值＜7.2的酸性培養(yǎng)液，細胞則其有一定的耐受，故配制細胞培養(yǎng)液時寧可稍偏酸也勿稍偏堿。如果實驗條件允許的話，最好在使用前先測定其pH值，以確保培養(yǎng)液的pH值是在細胞生長的最適范圍內(nèi)。同時，還應每天注意觀察細胞生長的情況及細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液的顏色變化，以便及時換液或添加NaHCO3。對于條件較好的實驗室，可以直接將細胞培養(yǎng)瓶瓶口微旋，放入CO2孵箱中培養(yǎng)，在飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)［6，7］，這樣可以使細胞在整個生長周期中的pH值保持恒定，避免在細胞生長后期因數(shù)量多、代謝快而引起細胞培養(yǎng)液的pH值下降，最終導致細胞的脫落和死亡。

細胞培養(yǎng)最適生長條件是實驗成功、企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的前提，本文對MRC-5細胞培養(yǎng)液的最適pH值范圍進行了科學性和重復性研究，為MRC-5細胞培養(yǎng)后續(xù)階段的研究打下堅實的基礎。

［1］ 李元.基因工程藥物［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2002:82－86.

［2］ 張文娟，紀衛(wèi)東，楊淋清，等.人胚肺成纖維細胞復制性衰老及過氧化氫誘導的早衰研究［J］.衛(wèi)生研究，2009，38(2):139－143.

［3］ Saeed K，Pelosi E.Comparison between turnaround time and cost of herpes simplex virus testing by cell culture and polymerase chain reaction from genital swabs［J］.Int J STD AIDS，2010，21(4):298－299.

［4］ 戴永祥，管政德，胡曉玉，等.人二倍體細胞 KMB－17株和MRC-5株生物學性質(zhì)比較［J］.動物學研究，1985，6(4):313－317.

［5］ 李亞東，牛建昭，王繼峰，等.循環(huán)纖維細胞和人胚肺成纖維細胞的比較研究［J］.解剖學報，2007，38(3):300 －303.

［6］ 李映紅，吳正治，吳偉康，等.天然腦活素促細胞增殖和抗細胞衰老作用的研究［J］.深圳中西醫(yī)結合雜志，2007，17(6):336－340.

［7］ 婁小燕，孫愛軍，王克強，等.電轉(zhuǎn)染技術促進人胚肺二倍體成纖維細胞的衰老進程究［J］.上海醫(yī)學，2009，32(4):308－311.