楊相政 李喜宏 馬宏原 申靈敏

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

飼料在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸儲(chǔ)藏過程中會(huì)因?yàn)楦鞣N自然環(huán)境因素使飼料的原有養(yǎng)分降低和品質(zhì)的劣化，嚴(yán)重者導(dǎo)致畜禽采食后中毒或死亡［1－2］。飼養(yǎng)的動(dòng)物食用了細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)的飼料，一旦免疫力降低，就會(huì)引發(fā)疾病，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。影響飼料品質(zhì)最重要的因素是霉菌的破壞，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計(jì)，全世界每年大約有5%～7%的糧食、飼料等農(nóng)產(chǎn)品遭受霉菌的侵蝕，全世界每年由此造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)千億美元。我國每年因?yàn)樵趦?chǔ)藏過程受到霉菌污染而變質(zhì)浪費(fèi)的飼料占總產(chǎn)量的15%左右［3］。因此，飼料霉菌毒素感染已成為飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問題。

飼料的腐敗變質(zhì)主要是發(fā)生在儲(chǔ)藏期間，霉變飼料中的霉菌毒素不僅降低了飼料的營養(yǎng)價(jià)值，還會(huì)誘發(fā)畜禽的急慢性中毒，嚴(yán)重時(shí)還可造成畜禽中毒死亡，其中影響最強(qiáng)、毒性最大的黃曲霉毒素B1能引起動(dòng)物急性中毒死亡，有強(qiáng)烈的致癌作用［4－5］，還會(huì)影響奶、蛋、肉等畜產(chǎn)品的質(zhì)量，直接危害人的健康。因此研究如何防止飼料的的腐敗變質(zhì)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前國內(nèi)外對(duì)雞飼料加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏期間防止霉菌腐敗變質(zhì)的研究主要集中在添加防腐劑、防腐包裝和射線照射結(jié)合化學(xué)處理等［5］，其中運(yùn)用最多是添加防腐劑防腐。但是防霉劑不能完全保證飼料不霉變，只能在一定條件下延長飼料霉變的時(shí)間［6］，而且作用的范圍有限［7］。對(duì)于氣調(diào)儲(chǔ)藏飼料防霉變鮮有報(bào)道。

糧食氣調(diào)儲(chǔ)藏是國際上應(yīng)用較為普遍和先進(jìn)的糧食儲(chǔ)藏方法之一，可以比較好的保持糧食品質(zhì)，殺滅害蟲，防止有害微生物的生長［8］。本試驗(yàn)采用高CO2氣調(diào)儲(chǔ)藏技術(shù)儲(chǔ)藏雞飼料，通過測(cè)定分析雞飼料的細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和黃曲霉總數(shù)的變化，研究高CO2對(duì)雞飼料霉變的調(diào)控效應(yīng)，以期為CO2氣調(diào)儲(chǔ)藏雞飼料的應(yīng)用提供技術(shù)參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

雞飼料:天津市新星獸藥廠，主要成分為玉米60%、豆粕13%和麩皮9%，含水量11%。

1.2 主要儀器和試劑

DK－98－1型數(shù)顯恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;WH－3微型漩渦混合儀:上海滬西分析儀器有限公司;SHZ－82型恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司;YXZ280B型高壓滅菌鍋:上海三申醫(yī)療器械有限公司;YS100型Nikon生物顯微鏡:上海澤仕光電科技有限公司;手持式O2/CO2分析儀:北京卓川電子科技有限公司;甲醇:天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;毒素檢測(cè)試劑盒:上海必發(fā)生化科技有限公司

1.3 處理方法

稱取每份1 kg雞飼料裝入布袋，再放入10 L氣調(diào)瓶中，充入不同濃度的CO2和O2的混合氣體。儲(chǔ)藏的氣體條件為:自然空氣(CK)、2%～3%O2+30%CO2(TR1)、2%～3%O2+50%CO2(TR2)。在實(shí)驗(yàn)室低溫糧食保鮮庫內(nèi)，調(diào)節(jié)TD－2型溫度梯度箱工作溫度分別為0、10、23和30℃，將各處理分別置于不同溫度的梯度箱內(nèi)，儲(chǔ)藏時(shí)間4月，定期使用手持式O2/CO2分析儀定期檢測(cè)氣體變化，調(diào)整氣體環(huán)境。每30 d取樣測(cè)定1次指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 細(xì)菌總數(shù)

測(cè)定程序參照GB/T 13093—2006《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》方法測(cè)定。所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基。

1.4.2 霉菌總數(shù)

測(cè)定程序參照GB/T 13092—2006《飼料中霉菌總數(shù)的測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。所用培養(yǎng)基為高鹽察氏培養(yǎng)基。

1.4.3 黃曲霉總數(shù)

測(cè)定程序參照GB/T 4789.16—2003《常見產(chǎn)毒菌的鑒定》對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。

1.4.4 黃曲霉毒素B1含量的檢測(cè)

利用Bcacon毒素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行飼料中毒素含量的檢測(cè)。已提供的試劑與材料有:真空包裝且包含干燥劑的8 mm×12 mm的微孔板;5瓶質(zhì)量濃度分別為 0、2.0、4.0、10、25 μg/kg 的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品;1瓶酶標(biāo)記物;1瓶底物溶液;1瓶停止液。

1.4.4.1 提取液的制備

將80 mL甲醇和20 mL蒸餾水置于錐形瓶中，震蕩搖勻。

1.4.4.2 樣品制備

粉碎后的樣品過20目篩，稱取50 g樣品和5.0 g氯化鈉置于帶塞錐形瓶中，并向其中加入100 mL甲醇/水(80∶20)提取液，搖勻，靜置2～3 min使樣品沉淀，然后用玻璃纖維濾紙過濾10 mL萃取液，取5 mL萃取液用20 mL蒸餾水稀釋，過濾稀釋液待測(cè)。

1.4.4.3 檢測(cè)程序

先將毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品液加入測(cè)試孔中，然后向測(cè)試孔中加入毒素的酶標(biāo)記物，樣品及酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合連接在微孔上的抗體，10 min培養(yǎng)后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未結(jié)合的霉菌毒素和酶標(biāo)記物，加入無色的底物溶液，培養(yǎng)10 min，所有結(jié)合的酶標(biāo)記物使底物轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)。加入停止液，然后將測(cè)試孔放在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，未知濃度樣品與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值進(jìn)行比較，就可以得到樣品的黃曲霉毒素B1的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用SPSS10.0軟件檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)

當(dāng)溫度一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著二氧化碳濃度的升高，其抑菌效果越明顯。但是超出一定濃度界限時(shí)，隨著二氧化碳濃度升高，抑菌效果反而下降［8］。褚益可等［9］研究牛肉的氣調(diào)保鮮結(jié)果表明:不是CO2濃度越高其抑菌效果越強(qiáng)，當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到45%后，其抑菌能力反而隨著CO2濃度的升高而下降。

不同的氣體環(huán)境對(duì)飼料中細(xì)菌總數(shù)的影響較大(表1)。在0℃時(shí)，高濃度CO2對(duì)雞飼料抑菌效果很明顯。雞飼料在30%CO2和50%CO2的條件下儲(chǔ)藏90 d細(xì)菌總數(shù)都小于限量標(biāo)準(zhǔn)2×106cfu/g，前60 d細(xì)菌增長相對(duì)較慢;10℃時(shí)，30%CO2和50%CO2的條件下儲(chǔ)藏60 d后，細(xì)菌總數(shù)不超標(biāo);30℃時(shí)，30%CO2和50%CO2的條件下儲(chǔ)藏30 d內(nèi)，細(xì)菌總數(shù)不超標(biāo)。當(dāng)溫度一定時(shí)，CO2體積分?jǐn)?shù)為0%～50%的范圍內(nèi)，隨著二氧化碳濃度的升高，對(duì)細(xì)菌生長的抑制就越明顯(圖1)。

表1 細(xì)菌菌落總數(shù)均值

圖1 雞飼料不同濃度CO2處理同一稀釋濃度下儲(chǔ)藏60 d后細(xì)菌菌落圖

2.2 霉菌總數(shù)的檢測(cè)

氣體對(duì)真菌的代謝活動(dòng)有明顯影響。高濃度二氧化碳?xì)怏w環(huán)境下，霉菌孢子很難萌發(fā)，繁殖較慢［9］。

如表2和圖2可知，當(dāng)溫度一定，高濃度的CO2對(duì)霉菌的生長有明顯的抑制作用。0℃時(shí)，30%CO2下，霉菌生長極其緩慢，儲(chǔ)藏120 d后，霉菌總數(shù)遠(yuǎn)小于對(duì)照組(CK)，低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)4.5×103cfu/g;50%CO2時(shí)，霉菌幾乎不生長，總數(shù)基本不變。10℃時(shí)，CO2體積分?jǐn)?shù)為30%和50%條件下，飼料儲(chǔ)藏120 d后，霉菌總數(shù)不超標(biāo)，而對(duì)照組儲(chǔ)藏60 d后，霉菌總數(shù)超過限量標(biāo)準(zhǔn)，飼料已經(jīng)霉變。30℃時(shí)，高濃度的CO2對(duì)霉菌的抑制效果不是特別顯著，CO2體積分?jǐn)?shù)為30%和50%時(shí)，飼料儲(chǔ)藏超過60 d霉菌均低于限量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組儲(chǔ)藏30 d后，霉菌已經(jīng)超標(biāo)，飼料的營養(yǎng)成分已經(jīng)受到霉菌的破壞。

表2 霉菌菌落總數(shù)均值

圖2 雞飼料不同濃度CO2處理同一稀釋濃度下儲(chǔ)藏60 d后霉菌菌落圖

2.3 黃曲霉總數(shù)的檢測(cè)

當(dāng)二氧化碳體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%以上時(shí)，能抑制小麥或玉米內(nèi)的霉菌生長及青霉或黃曲霉毒素的產(chǎn)生［10－11］。由表3和圖3可知，高濃度 CO2明顯抑制雞飼料內(nèi)黃曲霉的生長，并且濃度越高，效果越明顯。當(dāng)溫度為0℃和10℃時(shí)，50%CO2對(duì)黃曲霉生長抑制顯著，黃曲霉生長緩慢;當(dāng)溫度為30℃時(shí)，抑菌效果不顯著，這與霉菌總數(shù)增長趨勢(shì)一致。可見，高濃度CO2對(duì)于常溫和低溫儲(chǔ)藏下的雞飼料內(nèi)霉菌的生長抑制效果顯著，而對(duì)于高溫儲(chǔ)藏下的雞飼料內(nèi)的霉菌生長抑制效果不顯著。

表3 黃曲霉菌菌落總數(shù)均值

圖3 飼料中黃曲霉菌落的不同形態(tài)

2.4 常溫儲(chǔ)存下黃曲霉毒素隨時(shí)間的變化情況

高濃度CO2處理可有效抑制雞飼料常溫儲(chǔ)藏過程中黃曲霉毒素B1含量的變化，而對(duì)照組黃曲霉毒素B1含量變化很大。由圖4可知，儲(chǔ)藏到90 d，30%CO2和50%CO2處理的雞飼料黃曲霉毒素B1的含量分別為 19.3 μg/kg 和 12.6 μg/kg，均低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)20μg/kg。儲(chǔ)藏到120d，50%CO2處理的雞飼料黃曲霉毒素B1的含量為17.4 μg/kg，仍低于國家標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)照組黃曲霉毒素B1的含量為56.2 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國家標(biāo)準(zhǔn)，而且飼料已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重霉變，顏色變黑，有惡臭，幾乎失去使用價(jià)值。因此高濃度的能有效抑制飼料中霉菌特別是黃曲霉的生長，進(jìn)而抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。

圖4 不同濃度CO2處理對(duì)黃曲霉毒素B1含量的影響

3 結(jié)論

3.1 當(dāng)溫度一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，CO2濃度越高，對(duì)雞飼料內(nèi)細(xì)菌和霉菌的抑制效果越顯。高濃度的CO2對(duì)于常溫和低溫儲(chǔ)藏下的雞飼料內(nèi)霉菌的生長抑制效果顯著，而對(duì)于高溫儲(chǔ)藏下的雞飼料內(nèi)的霉菌生長抑制效果不顯著。

3.2 高濃度CO2對(duì)于室溫下儲(chǔ)藏的雞飼料內(nèi)黃曲霉的生長以及黃曲霉毒素B1含量的變化有明顯的影響，50%CO2處理能明顯抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生，進(jìn)而防止飼料霉變變質(zhì)。

3.3 10℃ +30%CO2和常溫+50%CO2的儲(chǔ)藏環(huán)境可有效抑制雞飼料內(nèi)細(xì)菌和霉菌的生長，用于雞飼料防霉儲(chǔ)藏。雞飼料在此條件下儲(chǔ)藏90 d細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)以及黃曲霉毒素均低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

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