張文平，張貴華，柯 瑾，馬云淑

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

馬錢子又名苦實(shí)、番木鱉、馬錢子等，味苦、性寒，有大毒，為馬錢子科馬錢子屬植物馬錢子（Strychnos nux-vomica）或云南馬錢（Strychnos pierriana）的干燥成熟種子，具有改善微循環(huán)，增加血流、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌作用[1]。可用于治療腦血管病后偏癱及面癱、癌癥疼痛、坐骨神經(jīng)痛、頸椎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[2]。馬錢子的藥理和臨床應(yīng)用價(jià)值非常突出，馬錢子堿和士的寧是主要藥效成分，并能相互促進(jìn)吸收[3]。為了對(duì)馬錢子主要有效成分的透皮給藥制劑及其他制劑提供馬錢子提取物，本實(shí)驗(yàn)采用回流提取法，以士的寧與馬錢子堿總量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選其最佳提取工藝，為以后進(jìn)一步研究提供科學(xué)合理的現(xiàn)代制劑實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1100）；TYS-100型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；T-1000型電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；DZF型真空干燥箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

馬錢子原藥材（購自菊花村中藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室楊樹德教授鑒定為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子）；士的寧對(duì)照品（購自中國生物制品檢定所，批號(hào)：110705-200306）；馬錢子堿對(duì)照品（購自中國生物制品檢定所，批號(hào)：110706-200505）。無水乙醇、硫酸、鹽酸、磷酸等為分析純，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

采用高效液相色譜法，色譜柱為LicrospherC18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（23：77），10%磷酸調(diào) pH 值為 2.8；流速為 1mL/min；檢測(cè)波長：260nm，進(jìn)樣量 10μL；柱溫：30℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取士的寧堿對(duì)照品6mg、馬錢子堿對(duì)照品5mg，分別置于10mL容量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取2mL，置同一10mL中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（士的寧0.12mg/mL、馬錢子堿0.10mg/mL）。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取生馬錢子粗粉（過2號(hào)篩，下同）10.000g置于250mL圓底燒瓶中，按照正交試驗(yàn)表加熱回流提取3次，抽濾，合并提取液。分別用各自濃度乙醇定容至250mL容量瓶中搖勻，密取吸取1mL提取液用各自濃度的乙醇定容至10mL容量瓶中，離心10min，頻率（5000r/min），取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對(duì)照品溶液 1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μL注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1491.386x+20.75，r=0.9998；士的寧標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1873x+8.041，r=0.9999。結(jié)果表明馬錢子堿進(jìn)樣量在0.1～1.0μg；士的寧進(jìn)樣量在0.125～1.2μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定士的寧與馬錢子堿峰面積，計(jì)算含量。

2.2 提取工藝設(shè)計(jì)

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 提取溶劑的選擇[4-5]

精密稱取馬錢子粉8份10g，分別加8倍量下列溶劑（蒸餾水、0.5mol/L硫酸、1mol/L鹽酸、1mol/L硝酸、1%硝酸、50%乙醇、堿性氯仿（加氫氧化鈉試液混勻），浸泡30min，第一次回流提取2h，第二次1h，第三次0.5h，每次提取液均要分別收集，最后分別合并并稀釋定容到250mL，按2.1.5項(xiàng)下方法測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑馬錢子堿和士的寧提取量

氯仿毒性大，而硝酸破壞馬錢子生物堿成分，酸水溶出雜質(zhì)多，通過比較馬錢子堿和士的寧的提取率大小，綜合各種因素，最終選擇50%乙醇最為最佳溶劑。

2.2.1.2 溶劑pH的考察

取馬錢子粉12份，每份10g，分別加鹽酸和氫氧化鈉調(diào) pH=3，5，7，9 的 50%乙醇 80mL，浸泡30min，回流提取3次，每次1h，將提取液抽濾并收集濾液，合并每次濾液定容到250mL，精密取1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，3000r/min離心10min，取上清液用0.45μm的微孔濾膜過濾并裝入進(jìn)樣瓶中，參照2.1.5項(xiàng)下含量測(cè)定方法，精密吸取10μL，HPLC測(cè)定士的寧與馬錢子堿總量。結(jié)果表明，pH在5~7之間為宜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同PH馬錢子堿和士的寧提取量

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.2.1 因素水平的確定與考察指標(biāo)[6]

以50%乙醇為溶劑，選取乙醇濃度A、乙醇用量B、回流時(shí)間C為考察因素，以士的寧與馬錢子堿總含量為指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)。提取工藝優(yōu)選因素水平表見表3。

表3 提取工藝因素水平表

2.2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

精密稱取生馬錢子粗粉（過2號(hào)篩，混勻）27份（每號(hào)實(shí)驗(yàn)平行3次），每份約10g，置于250mL圓底燒瓶中，加熱回流提取3次，抽濾，合并提取液。分別用不同濃度乙醇定容至250mL容量瓶中搖勻，密取吸取1mL提取液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，3000r/min離心10min，取上清液，按2.1.5項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定含量，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

通過正交試驗(yàn)直觀分析，方差分析表可知，各因素影響順序?yàn)锳>C>B，其中乙醇濃度對(duì)士的寧與馬錢子堿的提取結(jié)果影響最大，理論最佳提取工藝條件為A1B3C3，即加50%乙醇提取3次，加醇量為10倍量，每次2h。

表4 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 方差分析表

2.2.3 提取工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

平行稱取藥材粗粉3份，每份10g，精密稱定，按優(yōu)選出的工藝進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6。結(jié)果表明正交試驗(yàn)優(yōu)選的工藝條件較好，說明此工藝合理可行。

3 討論

生馬錢子為苦寒大毒之品，臨床醫(yī)生多畏之，即使用者也以外用居多。而鑒于其外用的療效確切，劑量小，治療藥效強(qiáng)，工業(yè)化生產(chǎn)更顯得重要，本實(shí)驗(yàn)為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了科學(xué)合理可行的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

馬錢子粉用50%乙醇浸泡30min后按篩選出的工藝提取，馬錢子總堿提取率比不浸泡高。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

目前對(duì)馬錢子中士的寧與馬錢子堿總量的提取方法的報(bào)道較少，以回流提取法提取率較高，而報(bào)道有用65%乙醇10倍量、回流3次，每次1h的提取方法，但其也僅僅以士的寧提取率為指標(biāo)，考察不夠全面，且優(yōu)選對(duì)象為制馬錢子，綜上考慮，本實(shí)驗(yàn)用50%乙醇為溶媒，以馬錢子堿和士的寧2種主要成分的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)對(duì)生品馬錢子的醇提工藝進(jìn)行全面正交優(yōu)選，最佳工藝結(jié)果表明兩生物堿的提取率較高，證明該工藝合理。

本實(shí)驗(yàn)參照2010版藥典（一部）方法直接測(cè)定提取液中馬錢子堿和士的寧的含量，簡單可行，省去了后續(xù)萃取純化過程，減少生物堿成分損失。

[1]旭坤，蔡寶昌.Brucine對(duì)Heps荷瘤小鼠的抗腫瘤作用和毒性的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（1）：35-39.

[2]焦楊.馬錢子的研究進(jìn)展 [J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2009，22（8）：918-919.

[3]朱建偉，武繼彪.李成韶，等.馬錢子堿鎮(zhèn)痛作用及其藥效動(dòng)力學(xué)研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2005，12（3）：166.

[4]湯淮波，張令君，李湘玲，等.不同溶劑提取馬錢子中士的寧與馬錢子堿的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，15（11）：52-53.

[5]祁艷，陳軍.馬錢子總生物堿提取純化工藝及抗腫瘤研究[J].中成藥，2010，32（3）：405-408.

[6]王利杰，蔡寶昌，陳軍，等.生馬錢子醇提工藝正交設(shè)計(jì)優(yōu)選[J].中成藥，2009，31（4）：629-631.