蘇 健

（昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650032）

“雪膽素片”是云南省在上世紀(jì)80年代初從彝族藥物“羅鍋底”開發(fā)的成藥制劑，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》[1]，具有清熱解毒，抗菌消炎之功效，用于菌痢、腸炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等[2]。其藥效物質(zhì)是從羅鍋底Hemsleya maerosperma C.Y.Wu等葫蘆科雪膽屬植物中提取的“雪膽素”，主要含有三萜類成分雪膽素甲（Cucurbitacin IIa）和雪膽素乙（Cucurbitacin IIb）[3]。

在“雪膽素片”及其原料藥“雪膽素”現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，其質(zhì)量控制項(xiàng)的定量測(cè)定部分采用的是分光光度法測(cè)定雪膽素甲的含量。隨著藥品安全要求的提高和藥品質(zhì)量控制技術(shù)的發(fā)展，該方法已經(jīng)不能適應(yīng)目前行業(yè)發(fā)展需求。經(jīng)過較為系統(tǒng)的研究，我們建立了一種測(cè)定雪膽素片中雪膽素甲含量的高效液相色譜方法，可用于雪膽素及其制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高液相色譜儀（美國安捷倫公司），HPLC 1100 ChemStation工作站；AEG-45SM 型百萬分之一分析天平（日本島津公司）；上海Branson B3200S超聲清洗器；依利特色譜柱（Kromasil C18填料，4.6×150mm，5μm）。對(duì)照品雪膽素甲由中國食品藥品檢定研究院提供（編號(hào)111518）。流動(dòng)相用乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。雪膽素片藥品為昆明宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

2.1.1 色譜條件

經(jīng)過優(yōu)選的色譜條件如下：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱溫25℃；流動(dòng)相用乙腈-水的混合溶液（40∶60），流速1mL/min，檢測(cè)波長212nm，進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)以雪膽素甲峰計(jì)算不低于6000。在此條件下（圖1），雪膽素甲對(duì)照品峰的拖尾因子為0.99，雪膽素片樣品中雪膽素甲和鄰近峰分離大于2.0，陰性對(duì)照樣品無干擾，符合藥品分析的一般技術(shù)要求。

圖1 雪膽素甲（a）、雪膽素片（b）、陰性對(duì)照樣品（c）的高效液相色譜

2.1.2 檢測(cè)波長確定

取雪膽素甲對(duì)照品以甲醇溶解，以甲醇作空白對(duì)照在200～400nm波長范圍掃描紫外吸收，結(jié)果在212nm波長處有最大吸收，故選擇212nm為檢測(cè)波長，結(jié)果見圖2。

圖2 雪膽素甲紫外吸收曲線

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的雪膽素甲對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的溶液，臨用時(shí)用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液制備

取雪膽素片，研細(xì)，取約0.7g，精密稱定，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理10min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，臨用時(shí)用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

按上述方法制備雪膽素甲對(duì)照品溶液，濃度為0.242mg/mL，分別精密量取對(duì)照品溶液 1μL，2μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸處理，回歸方程為Y=246.53X+9.0096，r=0.9999（n=7）。結(jié)果表明，雪膽素甲在進(jìn)樣量0.242～6.05μg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值的平均值為605.26，RSD 為 0.36%（n=6），結(jié)果見表 2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)雪膽素片（20120902），依法制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定7次，每次間隔4h，測(cè)得峰面積積分值平均值為592.63，RSD為1.52%（n=7）。結(jié)果表明，樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)雪膽素片（20120902），平行取6份樣依法制成供試品溶液，按上述色譜條件外標(biāo)法測(cè)定雪膽素甲的含量，以標(biāo)示量計(jì)雪膽素甲的平均含量為104.37%，RSD為0.26%（n=6）。結(jié)果表明，該法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表4。

表4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的雪膽素片（批號(hào)：20120902，8.26mg/g）研細(xì)，取9份，每份0.35g，精密稱定，再分別加入雪膽素甲對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備和樣品測(cè)定項(xiàng)下操作，平均回收率為96.80%，RSD為 0.44%（n=9），結(jié)果見表 5。

2.9 樣品測(cè)定

取雪膽素片樣品共10批，按照上述確定的方法測(cè)定，結(jié)果見表6。

3 討論

葫蘆科雪膽屬植物中富含三萜類成分，其中以雪膽素類成分為主[4]。雪膽素具有較高的藥理活性，有廣譜抗菌效果，并且對(duì)心血管系統(tǒng)也有作用，雪膽屬植物分布比較廣泛，其中又以云南和浙江資源較豐富[5]，以雪膽屬植物開發(fā)的制劑品種繁多[6]，因此有效控制好這類制劑的質(zhì)量有重要的意義。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

現(xiàn)行雪膽素片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用可見紫外分光光度法測(cè)定雪膽素甲的含量，此方法用比色法定量，利用化學(xué)顯色的模式測(cè)定吸光度，以發(fā)色官能團(tuán)的表征來測(cè)定總量，但測(cè)定結(jié)果包含具有相同官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的三萜同系物，轉(zhuǎn)專屬性差，同時(shí)受實(shí)驗(yàn)操作、環(huán)境條件等因素影響較大。而高效液相色譜方法是在色譜分離的基礎(chǔ)上，對(duì)于特定位置的吸收峰進(jìn)行定量，更具有專屬性，測(cè)定結(jié)果更客觀，并且實(shí)驗(yàn)操作更簡化，受環(huán)境等條件影響更小。

現(xiàn)研究采用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定雪膽素甲的含量，在專屬性、準(zhǔn)確度、靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等方面均能達(dá)到藥品分析的技術(shù)要求，可作為雪膽素及其制劑的定量檢測(cè)方法，更好地控制其質(zhì)量。

表6 雪膽素片的含量測(cè)定結(jié)果

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).WS3-B-3694-98《衛(wèi)生部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第19冊(cè)[S].1998：202.

[2]陳夏靜，伍怡穎，匡文娟，等.雪膽素片抗炎鎮(zhèn)咳作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].四川生理科學(xué)雜志，2009，31（4）：153-154.

[3]聶瑞麟，陳宗蓮.雪膽屬植物化學(xué)研究歷史和現(xiàn)狀[J].云南植物研究，1986，8（1）：115-124.

[4]徐曉婷，鄧志鵬，仲浩，等.雪膽素的研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2012，31（10）：600-601.

[5]曾慶通，黃永超.雪膽的綜合利用[J].藥事通報(bào)，1980（5）：5-7.

[6]楊群芳，王賢英.中藥雪膽及其制劑的研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2003，12（9）：76-77.