高飛, 孫鵬, 陳靜, 李章磊, 張孜宸, 李華云, 王寧, 周宜君

中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 北京 100081

College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081, China

蒙古沙冬青保守microRNAs的鑒定及靶基因預(yù)測

高飛, 孫鵬, 陳靜, 李章磊, 張孜宸, 李華云, 王寧, 周宜君

中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 北京 100081

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是生長在荒漠中的木本植物, 對于我國西北部干旱、半干旱區(qū)域的植被維護與恢復(fù)具有重要價值。蒙古沙冬青對干旱、低溫等多種逆境具有較高的耐受性, 是研究林木耐受逆境生理與分子機制的合適材料。MicroRNA(miRNA)是一類長度約為21個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前, 許多植物物種的miRNAs已經(jīng)獲得鑒定, 但未見蒙古沙冬青miRNAs的相關(guān)報道。文章應(yīng)用高通量測序和生物信息學(xué)分析方法對蒙古沙冬青幼苗保守miRNAs的類型、表達豐度以及靶基因進行了分析和預(yù)測。共鑒定了10個家族的19種保守miRNAs, 其表達豐度介于55～1920269個拷貝之間。通過在線軟件psRNATarget預(yù)測了其中14個保守miRNAs的靶基因。對于這些靶基因的功能分析表明, 蒙古沙冬青的保守 miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、激素信號途徑、物質(zhì)代謝和脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過程參與植物生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)。

蒙古沙冬青; microRNAs; 高通量測序; 靶基因預(yù)測

MicroRNA(miRNA)是一類在動植物生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子 RNA(約 21nt), 主要在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控蛋白編碼基因, 從而發(fā)揮其各種生物學(xué)功能[1]。目前,利用實驗和生物信息學(xué)方法, 圍繞miRNAs的鑒定、靶基因和功能分析已經(jīng)開展了較多的研究。miRNAs的鑒定主要采用直接克隆和生物信息學(xué)方法。近十幾年來, 植物 miRNAs的鑒定標(biāo)準不斷完善, 最早提出的是一個普遍適用的鑒定標(biāo)準[2], 隨后提出了針對植物 miRNAs的鑒定標(biāo)準[3], 近來有文獻報道了結(jié)合高通量測序的miRNAs鑒定標(biāo)準[4]。目前, 植物miRNAs鑒定的核心標(biāo)準為：證明該小RNA是從一個單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體的莖的部分準確解離下來的序列[3]。從基因組序列或者 EST序列上通過 Mfold等RNA折疊軟件[5]找到合格的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是miRNAs鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。植物miRNAs以近乎完全互補的方式與其靶基因的特定序列配對, 介導(dǎo)靶基因的切割和翻譯抑制, 其靶基因的預(yù)測可以采用生物信息學(xué)方法, 相關(guān)軟件預(yù)測效果較好, 目前常用的有psRNATarget[6]等多個靶基因預(yù)測軟件。

自2002年第一個植物miRNA被發(fā)現(xiàn)以來[7], 目前已經(jīng)有數(shù)千種植物的 miRNAs得到鑒定, 并提交到 miRBase數(shù)據(jù)庫[8]。對模式植物和其他已經(jīng)完成基因組測序物種的 miRNAs鑒定工作較多, 相比較而言, 在未進行基因組測序物種的 miRNAs研究報道較少, 特別是一些具有獨特生態(tài)價值的特殊生境植物的miRNAs研究工作仍為空白。盡管缺乏基因組信息, 物種的miRNAs鑒定非常困難, 但GenBank中快速增長的 EST數(shù)據(jù)將緩解這種困境。隨著Solexa等第二代測序技術(shù)的日臻成熟, 大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序成本迅速降低, 研究人員可以獲取高覆蓋度、高深度的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 促進了未進行基因組測序物種的miRNAs研究工作。

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)屬于豆科沙冬青屬, 是中亞地區(qū)第三紀孑遺種, 也是我國西北部荒漠地區(qū)罕見的常綠闊葉樹種[9]。蒙古沙冬青具有較強的抗旱、耐鹽堿和抗寒特性, 是植物抗逆機理研究和優(yōu)秀抗逆基因篩選、挖掘的重要材料[10]。近年來, 有關(guān)蒙古沙冬青的耐旱、耐寒生理生化和分子機制研究逐漸得到重視[11,12], AmCBL、AmLEA等多個耐逆相關(guān)基因已經(jīng)被克隆并進行了轉(zhuǎn)基因功能分析[13～15], 大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組測序工作已有報道[16,17]。但是, 作為參與植物逆境響應(yīng)的重要遺傳調(diào)控因子,蒙古沙冬青miRNAs的相關(guān)研究目前仍未見報道。

本文應(yīng)用 Solexa技術(shù)構(gòu)建蒙古沙冬青小 RNA文庫, 基于前期對蒙古沙冬青根和葉片進行的高通量測序所獲得的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 采用生物信息學(xué)方法鑒定蒙古沙冬青保守 miRNAs, 預(yù)測其靶基因, 有助于對蒙古沙冬青miRNAs結(jié)構(gòu)與功能的認識。

1 材料和方法

1.1 植物材料

蒙古沙冬青種子采集自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市。種子經(jīng)過浸泡一定時間后播種于蛭石：珍珠巖(1∶1)的混合土壤中, 每 2 d澆一次水。在光周期16 h/d、光照強度(光合有效光量子流密度)約為 93 μmol/m2·s1、相對濕度約為60%、溫度為23℃/18℃(日/夜)下培養(yǎng)。萌發(fā)后每4 d澆一次1/2 Hoagland 營養(yǎng)液, 幼苗生長約2 w, 待2片真葉完全展開后取根和真葉, 液氮速凍后用于RNA的提取。

1.2 總RNA的提取

采用Trizol Reagent(Invitrogen)試劑盒, 參照操作手冊進行總RNA的提取。用NanoDrop ND-1000和Hp2100檢測總RNA 的含量、純度及其完整性。

1.3 文庫構(gòu)建及測序

總RNA經(jīng)15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,將長度范圍在 17～30nt 的小 RNA(sRNA)切膠回收,純化后的小RNA分別經(jīng)5′接頭和3′接頭連接后進行RT-PCR 擴增, 形成小RNA的cDNA文庫, 用于高通量測序。深度測序使用Hiseq2000, 由華大基因公司(BGI)完成。

1.4 測序序列的初步加工和分析

Solexa測序獲得的短序列首先通過去除接頭序列、低質(zhì)量序列、污染序列, 統(tǒng)計序列長度分布等過程完成加工和初步分析。然后將初步加工得到的序列進行分類注釋, 獲取樣品中包含的各組分及表達量信息。

1.5 保守miRNA的鑒定及靶基因預(yù)測

蒙古沙冬青保守miRNAs的鑒定方法：(1)將加工后的小RNA序列(clean reads)與miRBase中植物的 miRNAs成熟序列進行比對, 允許不多于兩個 nt錯配以及若干個 gap; (2)對于上述比對結(jié)果中出現(xiàn)的所有 miRNAs家族, 取屬于不同物種同一家族中表達量最高的一條作為該物種可能的miRNA; (3)對于(2)中鑒定的 miRNA進行前體預(yù)測, 若比對的miRNA能夠定位到該物種轉(zhuǎn)錄組上, 并且能夠形成符合特定標(biāo)準的莖環(huán)結(jié)構(gòu), 則確定該序列為miRNA。(4)將選定的小RNA與構(gòu)建的小RNA文庫進行比對, 計算該小RNA分子的表達量, 表達量單位為“個拷貝”(read)。

通過分析前體序列, 確定莖環(huán)結(jié)構(gòu)及最低折疊自由能(Minimal folding free energies，MFEs)。根據(jù)成熟miRNA的序列計算(G+C)% 含量, 再根據(jù)前體長度(PL)計算調(diào)整最低自由能(Adjustment minimal folding free energies，AMFEs), 從而計算出最低折疊自由能系數(shù)(Minimal folding free energy indexes，MFEIs)。計算方法為：AMFEs=[(MFEs/PL)×100], MFEIs=AMFEs/(G%+C%)。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用 Mfold 3.2(http://mfold. bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi)[5]。采用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget)[6]軟件進行miRNAs的靶基因預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古沙冬青小RNA的序列信息

利用Solexa深度測序技術(shù)對蒙古沙冬青幼苗進行測序, 獲得了9 649 403個原始序列。其中, 長度為 24nt的序列數(shù)量最多, 其次為 21nt, 其他數(shù)量較多的序列長度依次為22nt、23nt、20nt和25nt。這種長度分布與其他植物的小RNA測序結(jié)果相似[18]。

對所獲得的原始序列通過去除低質(zhì)量序列、帶有接頭的序列, 以及短于 18nt的序列, 獲得可用于進一步分析的序列(clean reads)9 627 250個(表1)。

表1 高通量測序所獲得的序列概況

通過 Rfam比對等生物信息學(xué)分析方法, 本研究獲得了蒙古沙冬青幼苗小 RNA的類型及數(shù)量的初步結(jié)果(表2)。從表2中可以看出, 蒙古沙冬青幼苗小RNA中含量最多的為“其他序列”(包括siRNA、部分未經(jīng)鑒定的miRNA以及mRNA降解片段), 占全部小RNA數(shù)量的一半以上。其次為與已知miRNA序列相似的小RNA序列, 占28.32%。其他種類的小RNA所在比例依次為 rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA。

2.2 保守的miRNAs及前體分析

將蒙古沙冬青miRNAs分為兩部分：即物種間保守性 miRNAs [與其他植物物種已經(jīng)鑒定的miRNAs序列相似(差異≤2nt)]和物種特異性miRNAs [與其他植物物種已經(jīng)鑒定的miRNAs序列差異較大(＞2nt)]。根據(jù) miRNAs的鑒定標(biāo)準[3,4], 無論是保守miRNAs還是物種特異性miRNAs, 其鑒定均需要具有能折疊成較穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體序列存在的支持。由于目前還未進行蒙古沙冬青的基因組測序, 本文使用該物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行保守miRNAs的鑒定, 以及miRNAs靶基因的預(yù)測。

表2 蒙古沙冬青幼苗中小RNA的類型及數(shù)量

本文首先研究了測序獲得的小 RNA序列在轉(zhuǎn)錄組序列上的定位情況。使用SOAP軟件對加工后的序列與轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)進行比對, 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 4.8%的小 RNA序列存在于轉(zhuǎn)錄組序列上, 占全部小RNA數(shù)量的 33.91%(表 3), 說明定位到轉(zhuǎn)錄組序列上的小RNA的平均表達量(以測序次數(shù)計)比未定位到轉(zhuǎn)錄組序列上的小RNA的平均表達量高, 提示使用轉(zhuǎn)錄組進行miRNAs鑒定可能難以確定低表達量的miRNAs。鑒于保守miRNAs的表達量一般較高,所以在本研究中這個問題并不突出。很多小RNA序列沒有定位在轉(zhuǎn)錄組序列中, 可能是由于使用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的測序深度和覆蓋度仍有待進一步提高。實際上, 在使用基因組進行miRNAs鑒定的研究中,同樣有大量的小 RNA序列不能定位到基因組序列上, 如一種水螅(Hydra magnipapillata)沒有定位到其基因組序列中的小RNA序列占50.5%[19]。

本研究共鑒定了 19個保守的蒙古沙冬青miRNAs, 分屬于 MIR156、MIR159、MIR162、MIR166、MIR167、MIR168、MIR396、MIR403、MIR1507和MIR2118等共10個miRNAs家族, 表達豐度介于55～1 920 269個拷貝之間(表4)。除了miR159a.2的*鏈未被檢出外, 其他18個miRNAs的*鏈也被鑒定, 其表達量均為10個拷貝(reads)以上。本研究確定的miRNAs前體序列已經(jīng)提交GenBank,序列登錄號分別為KJ024076～KJ024092 (表4)。

在已鑒定的19個保守的miRNAs中, 表達量最高的是 miR156l, 屬于 MIR156家族成員(成熟序列為：TTGACAGAAGATAGAGAGCAC), 其表達量達到1 920 269個拷貝。其次為miR166b, 屬于MIR166家族成員(成熟序列為：TCGGACCAGGCTTCA

TTCCCC), 其表達量為 300 450個拷貝。第三是miR156a、miR156h和miR156w, 都屬于MIR156家族成員(序列為：TGACAGAAGAGAGTGAGCAC),表達量為164 736個拷貝。表達量最低的是miR403a (MIR403家族成員), 為55個拷貝。其他表達較低的還有MIR159和MIR162家族的某些成員。

本研究鑒定得到的大多數(shù)miRNAs的表達量都遠大于其*鏈。但是對于miR396b, 由于位于5′臂和3′臂的兩個miRNAs分子表達量相當(dāng), 依據(jù)miRBase的命名原則[3,4], 將其分別命名為 miR396b-5p(TTCCACAGCTTTCTTGAACTT)和 miR396b-3p(GCTCAAGAAAGCTGTGGGAGA)。

本研究所鑒定的miRNAs前體序列的最低自由能(MFEs)為36.3～100.4 kcal/mol, 最低折疊自由能系數(shù)(MFEIs)為0.57～1.16, 符合miRNAs二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性要求(表4)。與動物miRNAs相比, 植物miRNAs前體的長度變化較大。本研究鑒定獲得的多數(shù)miRNAs的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體長度為100nt左右, 但miR167a的前體較長, 達到335nt。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體產(chǎn)生不止一個成熟miRNA(表4中的miR159a.1和 miR159a.2), 這種情況在近年來的一篇關(guān)于擬南芥miRNAs的報道中有較為詳細的討論[20]。

表3 小RNA序列與轉(zhuǎn)錄組的比對結(jié)果

此外, 在小 RNA文庫中還發(fā)現(xiàn)了部分潛在的miRNAs, 如 miR1511(AACCAGGCTCTGATACCATGA), 以及 MIR160和 MIR166家族的某些成員(GCGTATGAGGAGCCAAGCATA, TCTCGGACCAGGCTTCATTCC), 其序列與其他植物中已知的對應(yīng)miRNAs的成熟序列完全相同, 但是在蒙古沙冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到的潛在的前體EST序列長度不夠, 不能折疊成符合標(biāo)準的莖環(huán)結(jié)構(gòu), 所以暫時無法確認為miRNAs。

2.3 靶基因預(yù)測

根據(jù)miRNAs與靶基因序列具有高度互補性的特點, 通過在線預(yù)測軟件 psRNATarget對鑒定獲得的蒙古沙冬青保守 miRNAs的潛在靶基因進行預(yù)測。具體參數(shù)采用默認選項。共預(yù)測出14個miRNAs的100多個靶基因。

采用 Blast將這些靶基因在擬南芥基因組中比對, 通過分析靶基因在擬南芥中的同源基因來解析其功能(表5)。結(jié)果表明, 除部分基因無比對結(jié)果外(表5中未列出), 其他多數(shù)靶基因為編碼轉(zhuǎn)錄因子基因, 另外部分基因編碼受體蛋白激酶, 以及糖、脂類、氨基酸等物質(zhì)代謝相關(guān)酶類分子。研究這些保守 miRNAs在其他植物中的靶基因, 可以發(fā)現(xiàn)它們的靶基因多為同源基因, 說明這些保守 miRNAs在不同物種中的功能具有保守性。對靶基因的功能分類分析表明, 在蒙古沙冬青中, 保守 miRNAs參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運輸和環(huán)境逆境響應(yīng)等多種生物學(xué)過程。

3 討 論

蒙古沙冬青主要分布于我國西北部以及部分中亞國家, 是第三紀孑遺種和阿拉善荒漠地區(qū)的建群種, 在荒漠植被的維持中具有重要作用, 對其進行分子生物學(xué)研究有助于人們加深對植物逆境耐受機制的認識。作為一種在植物逆境耐受中發(fā)揮重要調(diào)控功能的遺傳因子, miRNAs可能參與蒙古沙冬青的逆境應(yīng)答, 鑒定蒙古沙冬青保守 miRNAs并預(yù)測其靶基因可為進一步確定逆境響應(yīng) miRNAs, 闡述miRNAs在該植物逆境耐受中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

由于缺乏基因組或大量 EST序列用于尋找miRNAs的前體, 對于未進行基因組測序植物物種來說, 其 miRNAs鑒定工作難度較大。在一些報道中, 研究者僅基于與已知 miRNAs的序列相似性鑒定保守的miRNAs[18,21,22], 或者在未進行小RNA測序的前提下, 只利用生物信息學(xué)方法, 通過確認miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在鑒定miRNAs[23,24]。在本研究中, miRNAs的鑒定采用生物發(fā)生和表達兩個標(biāo)準：(1)該小 RNA分子必須真實存在。即在高通量測序結(jié)果中, 必須有 10個拷貝以上的表達量(不含變體的表達量)來支持該小 RNA的表達標(biāo)準; (2)找到該miRNA的前體。必須在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到能折疊成符合特定標(biāo)準的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本, 該miRNA必須定位在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部, 最好有*鏈存在, 且miRNA與*鏈的雙鏈結(jié)構(gòu)必須有 3′端突出。以上要求在miRNAs的最新鑒定標(biāo)準中被明確列出[4]。

依據(jù)以上標(biāo)準, 本研究鑒定了蒙古沙冬青19個保守miRNAs, 并通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了14個miRNAs的靶基因。這些 miRNAs中表達量最高的屬于MIR156家族成員, MIR156家族成員的靶基因主要為SBP家族的轉(zhuǎn)錄因子。SBP基因家族是植物特異轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 所有SBP基因都含有一段保守的核苷酸序列, 被稱為SBP盒(SBP-box)。SBP盒編碼的蛋白質(zhì)序列稱為SBP結(jié)構(gòu)域(SBP-domain),具有高度保守性。研究表明, SBP轉(zhuǎn)錄因子參與了花的形成及其后期發(fā)育、葉的形態(tài)建成、植株株形和環(huán)境信號應(yīng)答等多個生物學(xué)過程[25]。蒙古沙冬青MIR156家族成員較多, 表達量較高, 這與其主要靶基因SBP轉(zhuǎn)錄因子所發(fā)揮的廣泛生物學(xué)功能有關(guān)。

研究表明, 植物miR165靶向HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子, 如PHB和PHV, 在腋生分生組織和葉片發(fā)育中發(fā)揮重要作用[26]。在本研究中預(yù)測到一個蒙古沙冬青miR165的靶基因, Blast比對表明該基因編碼一個擬南芥 PHB蛋白同源物, 說明蒙古沙冬青 miR165的作用與其他植物的 miR165的功能相似。miR159在擬南芥中的靶基因為MYB轉(zhuǎn)錄因子基因[26], 在本文中未預(yù)測到此類靶基因, 但預(yù)測到參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 ARF5和參與環(huán)境脅迫和激素信號通路的受體激酶CRK8基因等。

植物miR396的靶基因主要包括GRF轉(zhuǎn)錄因子等[27], 本研究預(yù)測的蒙古沙冬青 miR396的靶基因不僅包括 ARF1、ARF3、ARF5、ARF7, 還包括RD21(一個逆境應(yīng)答基因), 這說明蒙古沙冬青miR396可能不僅通過參與生長素信號途徑影響植株發(fā)育, 還參與環(huán)境逆境應(yīng)答。

表5 蒙古沙冬青保守miRNAs靶基因預(yù)測結(jié)果

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(責(zé)任編委: 張根發(fā))

Identification and target prediction of conserved microRNAs in Ammopiptanthus mongolicus

Fei Gao, Peng Sun, Jing Chen, Zhanglei Li, Zichen Zhang, Huayun Li, Ning Wang, Yijun Zhou

Ammopiptanthus mongolicus, a woody plant growing in the desert, plays a vital role in vegetation maintaining and restoration in the arid region in northwest China. The plant exhibits an extremely high tolerance to abiotic stress such as drought and freezing stresses, and it has been used as an ideal model for abiotic stress tolerance research in trees. MicroRNA (miRNA) is a class of approximately 21nt endogenous non-protein-coding small RNA, which plays an important role in plant growth, development and responses to environmental stresses. By now, a large number of miRNAs have been reported in many plant species, but no studies describing A.mongolicus miRNA were published. In the present study, the types, expression levels, and putative target genes of conserved miRNAs in seedlings of A. mongolicus were ana-lyzed using small RNA deep sequencing technology and bioinformatics methods. Nineteen conserved miRNAs, which belong to 10 miRNA families, were identified, with abundance ranging from 55 to 1920269 reads. Target prediction analysis determined the target genes of 14 conserved miRNAs. The functional classification analysis indicated that the conserved miRNAs participate in the development and environmental response by regulating the biological processes including the transcription regulation, hormone signal transduction, metabolisms and stress resistance.

Ammopiptanthus mongolicus; microRNAs; deep sequencing technology; target prediction

College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081, China

2013-10-23;

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31070361, 31370356), 教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目(編號：210266)和國家985工程項目和高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃項目(編號：B08044)資助

高飛, 博士, 副教授, 研究方向：植物逆境分子生物學(xué)。Tel: 010-68932633; E-mail: gaofei@muc.edu.cn

周宜君, 博士, 教授, 研究方向：植物逆境分子生物學(xué)。E-mail: queenzhou@263.net

10.3724/SP.J.1005.2014.0485

時間: 2014-3-7 11:37:32

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140307.1137.001.html