耿勝榮，汪 蘭，廖 濤，夏和舟，＊

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照加工中心，湖北 武漢 430064；3.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430064）

明膠是一種水解膠原蛋白，具有可溶、增稠、熱可逆、成膜、乳化等理化性質(zhì)，在照相、工業(yè)、食品和醫(yī)藥方面有廣泛的應(yīng)用，其中制藥工業(yè)和生物醫(yī) 學(xué) 領(lǐng) 域[1－2]已 成 為 當(dāng) 今 應(yīng) 用 和 研 究 的 熱點[3－6]。明膠的主要成分是蛋白質(zhì)，其是細(xì)菌生長的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基，極易遭到病原菌污染而喪失應(yīng)用價值。在防止外來病原物侵染的同時，對明膠材料進(jìn)行滅菌更是必不可少的。在眾多的滅菌法中，輻照具有非接觸性、冷殺菌、穿透性強(qiáng)、操作方便等優(yōu)點，尤其適合穩(wěn)定性差的蛋白類材料。

輻照法應(yīng)用于明膠滅菌早在20年前就有相關(guān)報道，早期建立的明膠輻射滅菌工藝仍沿用至今。隨著輻射技術(shù)在各行業(yè)的推廣應(yīng)用，小規(guī)模輻射源現(xiàn)大部分已退役，源座和源強(qiáng)大幅增加，排列設(shè)計也有變化。輻射條件的變化必然帶來新的輻射效應(yīng)，另外，當(dāng)代明膠被賦予更多的應(yīng)用功能，人們對它的要求不僅停留在衛(wèi)生學(xué)水平上，因此，新的輻射滅菌工藝建立迫在眉睫。本文從輻射劑量入手，研究輻照前后明膠流變性、凝膠性、力學(xué)性能、熱學(xué)性能和結(jié)構(gòu)的變化，探索劑量與性能和微觀結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為確定最佳輻射劑量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠，國藥集團(tuán)，化學(xué)純；60Coγ輻照源，設(shè)計裝源容量1.85×1016Bq，現(xiàn)有放射性活度5.84×1015Bq，湖北省輻照實驗中心；凝膠滲透色譜，高效液相色譜泵（waters1515，美國）、waters2690D分離模塊、waters2410折射率檢測器、二支色譜柱（waters ultrahy drogel 2000，250）串聯(lián)使用；掃描電鏡，Quanta 200，荷蘭FEI公司；試驗機(jī)，深圳市瑞格爾儀器有限公司；示差掃描量熱儀，DSC200F3，德 國 Netzsch 公 司；質(zhì) 構(gòu) 儀，TAXTPlus，英國SMS公司；電泳儀，DYY-12，北京六一儀器廠；50mL稀釋型烏氏黏度計等。

1.2 輻照處理

明膠（含水量約為7.5%）用自封口袋包裝，每份50g。采用動態(tài)懸掛輻照的方式分別照射4～52kGy，每個劑量樣品附有兩支硫酸亞鐵劑量計跟蹤劑量，實測劑量計的平均值作為樣品的吸收劑量。以未輻照樣品作為對照。照射完后立即取樣測定各指標(biāo)。

1.3 測定方法

1.3.1 特性黏度 取0.5g明膠，加入14.5g蒸餾水，室溫溶脹，55℃水浴溶解，配制成初始濃度C0為3.33%的明膠水溶液。此后用蒸餾水逐次稀釋成原濃度的2／3、1／2、1／3和1／4。用0.45mm烏氏黏度計在37℃下測定不同濃度C的樣品流出兩刻度線的時間t和蒸餾水流出時間t0。依次計算相對黏度ηr＝t／t0、增比黏度ηsp＝ηr－1。以C為橫坐標(biāo)，ηsp／C和lnηr／C為縱坐標(biāo)作圖，兩條折線與y軸的截距H1和H2的平均值為H。H／C0即為特性黏度[η]。

1.3.2 斷裂伸長率及斷裂強(qiáng)度 取5g明膠，加44g蒸餾水，55℃水浴溶解，加入1g甘油，混勻，超聲脫氣30s后，倒入預(yù)先涂抹硬脂酸鈉的托盤中，將托盤放入鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥約4h后揭膜。將膜放在內(nèi)置Mg（NO3）2·6H2O過飽和溶液的干燥器（相對濕度52%）中平衡水分48h。平衡好的膜在拉力機(jī)配套的裁具上裁成條，測量厚度，上拉伸機(jī)。拉伸模式試驗標(biāo)準(zhǔn)GB 1040—92，定伸長率20%，標(biāo)距25mm，試驗速度100mm／min，定應(yīng)力0.1mPa，試驗面積1.56mm2。

1.3.3 凝膠強(qiáng)度 在文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，質(zhì)構(gòu)儀測定參數(shù)按美國試驗標(biāo)準(zhǔn)GMIA進(jìn)行。

1.3.4 熔化溫度及膠凝溫度 在文獻(xiàn)[8-9]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。取樣品5mg，雙蒸水10mg，用進(jìn)口鋁坩堝（耐馳儀器公司產(chǎn)）封裝，在20℃以下環(huán)境中平衡過夜。示差掃描量熱儀（DSC200F3）的溫度程序為：10～55℃，升溫速度5℃／min；55℃恒溫2min；55～10℃，降溫速度5℃／min，5℃恒溫2min，65℃結(jié)束。分別在升溫、降溫曲線中尋找吸、放熱峰，并分析峰溫、起始和結(jié)束溫度，即為熔化溫度和膠凝溫度。

1.3.5 相對分子質(zhì)量 采用高效液相色譜泵（waters1515）測定。方法在文獻(xiàn)[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行 改 進(jìn)。配 制 1 000mL 的 0.1mol／L Na2HPO4，其中含8g NaN3，用 NaH2PO4調(diào)節(jié)pH值至8.0，取500mL作為儲備液。另取500mL儲備液稀釋至2 000mL作為淋洗液；進(jìn) 樣 量 為 100μL，溶 劑 為 H2O-0.2mol／L NaNO3，淋洗液流速為0.6mL／min。標(biāo)樣為聚乙烯乙二醇，柱子溫度40℃，檢測器溫度40℃。

1.3.6 蛋白組分分布 SDS-PAGE電泳采用12%分離膠和4%濃縮膠，樣品濃度為2mg／mL，上樣量為20μL。濃縮膠電壓為60V，分離膠電壓為100V，電泳時間為2h左右。25%戊二醛水溶液固定電泳后的膠塊0.5h，考馬斯亮藍(lán)R250染色過夜，用脫色液脫色3次。脫色后的膠塊照相保存。

1.3.7 表面形貌分析 采用掃描電鏡進(jìn)行分析。配制未照射和照射57.9kGy的明膠10%的水溶液各100mL，低溫下形成凝膠后，在－80℃冰箱速凍，再凍干，取少量凍干樣品做表面和截面掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 輻照劑量與明膠水溶液黏度的關(guān)系

不同輻照劑量對明膠溶液特性黏度和相對黏度的影響示于圖1。由圖1可看出，未輻照的明膠水溶液特性黏度和相對黏度分別為46.63mL／g和4.41。輻照后明膠水溶液兩種黏度隨劑量的增大均呈下降趨勢，低于17.2kGy輻照處理的樣品下降速度較快，高于17.2kGy輻照處理的樣品下降速度趨于平緩。生產(chǎn)常用8kGy輻照處理時，樣品的特性黏度和相對黏度分別為對照的88.5%和82.8%。特殊要求經(jīng)25kGy照射后，特性黏度和相對黏度分別為對照的65.3%和70.7%。這說明輻照降低了明膠的黏度。

圖1 不同輻照劑量對明膠溶液特性黏度和相對黏度的影響Fig.1 Effect of irradiation on intrinsic viscosity and relative viscosity of gelatin solution

2.2 輻照劑量與明膠膜力學(xué)性能的關(guān)系

不同輻照劑量對明膠膜力學(xué)性能的影響示于圖2。從圖2可看出，未輻照明膠膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為2.09MPa和228.97%，輻照后的明膠膜的斷裂強(qiáng)度升高，范圍在2.61～3.66MPa，而斷裂伸長率隨劑量的增加呈明顯的下降趨勢，范圍在90.19%～186.83%。這說明，輻照加大了膜的剛性，減小了膜的韌性。

圖2 不同輻照劑量對明膠膜力學(xué)性能的影響Fig.2 Effect of irradiation on tensile strength and elongation of gelatin film

2.3 輻照劑量與明膠膠凝特性的關(guān)系

2.3.1 凝膠強(qiáng)度的變化 凝膠強(qiáng)度反映凝膠體系的剛性程度，是藥用明膠國標(biāo)中的重要標(biāo)準(zhǔn)。明膠凝膠強(qiáng)度越大，說明分子相互纏結(jié)形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，網(wǎng)絡(luò)結(jié)點數(shù)越多[8]。圖3a為凝膠強(qiáng)度與劑量的關(guān)系。圖3b為凝膠強(qiáng)度測定圖譜，由測定時間與探頭感應(yīng)的力繪制的曲線為單峰型，取峰值為該樣品的凝膠強(qiáng)度。未輻照的明膠6.67%水溶液凝膠過夜，其凝膠強(qiáng)度為597.8g，輻照后明膠的凝膠強(qiáng)度隨劑量的增加呈下降趨勢。

圖3 不同輻照劑量對明膠凝膠強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of irradiation on strength of gelatin gel

圖4 明膠輻照后膠凝溫度和熔化溫度（a）以及DSC掃描圖（b）Fig.4 Gel point and melting point of irradiating gelatin（a）and DSC spectrum （b）

2.3.2 膠凝溫度和熔化溫度 熔膠－凝膠轉(zhuǎn)變臨界溫度點稱為膠凝溫度和熔化溫度。明膠輻照后膠凝溫度、熔化溫度和DSC掃描圖示于圖4。圖4b中升、降溫階段約5min和15min時分別出現(xiàn)了吸、放熱峰。從圖4a可見，對照的熔化溫度和膠凝溫度分別為26.1℃和43.9℃。除52.8kGy外，輻照后明膠樣品的熔化溫度均較對照的高，范圍為27.0～28.9℃。輻照后明膠樣品的凝膠溫度均較對照的低，范圍為40.8～42.4℃。輻照引起明膠的熔化溫度升高，說明分子吸熱解鏈熱能增加，明膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對熱穩(wěn)定，分子發(fā)生了交聯(lián)。輻照引起凝膠溫度降低，說明分子自發(fā)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)困難，分子發(fā)生了降解。熔化溫度低于凝膠溫度，且熔化時峰值處27.8℃熱流速度（0.444 7mW／mg）大于凝膠時峰值41.2℃處熱流速度（－0.395 4mW／

mg），這說明，明膠膠凝狀態(tài)與溶液態(tài)互轉(zhuǎn)時吸收和放出的熱能是不等量的。在本實驗中，明膠分子發(fā)生分解反應(yīng)的同時還伴隨少量的交聯(lián)，故有熔化溫度升高的現(xiàn)象。

2.4 輻照對明膠分子質(zhì)量及蛋白組分的影響

不同劑量輻照后明膠的凝膠滲透色譜圖和SDS-PAGE電泳圖示于圖5。從圖5a可見，未輻照明膠的GPC峰高而尖銳，輻照處理的明膠GPC出峰晚，且峰形變得矮而寬，劑量越大峰形越寬。結(jié)合GPC實驗給出的數(shù)值來看，未輻照明膠相對分子質(zhì)量分布為3.60，輻照后的相對分子質(zhì)量分布大于未輻照樣品，其范圍為3.85～4.76。未輻照明膠的相對數(shù)均分子質(zhì)量Mn、相對重均分子質(zhì)量Mw和相對峰位分子質(zhì)量Mp分別為48 863、175 864和59 759，輻照后明膠的3種相對分子質(zhì)量均隨劑量的增大而下降。這說明，輻照將大分子降解，形成更多種小分子的混合物。

圖5b中，未輻照明膠樣品可見β、α1和α2共3個條帶。在α1以上和以下部分，隨著劑量的加大，條帶逐漸加寬、變模糊、顏色下移。這說明β、α1和α2逐漸降解，降解成小分子肽段混合物，劑量越大，β、α1和α2含量越少，而肽段混合物越多。明膠的4種組分中，α1含量最高，也是最耐降解的，輻照46.6kGy后仍存在。其次是α2，輻照26.8kGy仍存在。γ、β含量較少，輻照降解也最快。

2.5 輻照對明膠結(jié)構(gòu)的影響

未輻照和57.9kGy輻照明膠表面及截面的SEM圖示于圖6。圖6a和圖6c分別為未輻照和輻照57.9kGy明膠的放大500倍表面圖，前者表面看到有顆粒，而后者表面光滑，成膜性好。這是因為經(jīng)輻照57.9kGy后，溶脹性差的大分子大部分降解為溶脹性較好的小分子，溶脹后分子排列更整齊，表面更光滑。圖6b、d分別為未輻照和輻照57.9kGy明膠的截面圖，后者的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較前者更為致密有序。這些說明，輻照促使了蛋白分子的分解和小量交聯(lián)，明膠表面更為致密，截面從疏散網(wǎng)狀轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅芫W(wǎng)狀。

圖5 不同劑量輻照后明膠的凝膠滲透色譜圖和SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Gel permeation chromatogram and SDS-PAGE analysis of irradiated gelatin

圖6 未輻照和57.9kGy輻照明膠表面及截面的SEM圖Fig.6 Scanning electron microscope photographs of surface and section of gelatin

3 討論

明膠是由少量三股螺旋鏈γ、兩股螺旋鏈β和單鏈α以及大量多聚肽組成的混合物[10]。明膠分子中的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)在發(fā)生氧化或自氧化反應(yīng)時形成醛基，促發(fā)多肽鏈之間以及膠原分子之間的交聯(lián)反應(yīng)[11]。交聯(lián)反應(yīng)與鏈的斷裂之間存在著競爭[12]。有報道認(rèn)為，明膠的輻射效應(yīng)主要是裂解占優(yōu)勢[13]。本研究結(jié)果與報道存在異同點。本文認(rèn)為，明膠在有氧和有限水的條件下，輻照以降解為主，交聯(lián)為輔。明膠在0～57.9kGy范圍內(nèi)有氧輻照后，黏度、凝膠強(qiáng)度、膠凝溫度、Mn、Mw和Mp，α、β、γ組分含量隨劑量的增加而下降，而多肽混合物含量、相對分子質(zhì)量分布寬度隨劑量的增加而增加。根據(jù)高斯方程，黏度越小對應(yīng)黏均分子質(zhì)量越小，輻射后黏度的下降說明黏均分子質(zhì)量的下降。凝膠強(qiáng)度與明膠的α組分是呈正比的[7]，其下降說明α組分含量的下降。凝膠滲透色譜結(jié)果和SDSPAGE分析更直接說明了這一點：輻照劑量越大，分子質(zhì)量和蛋白組分的降解越明顯，輻射降解后的明膠膜更平，結(jié)構(gòu)更為致密。

但另一方面，超過17.2kGy劑量輻照的明膠水溶液中有明顯不溶物。這說明輻照引起明膠分子分解的同時，也發(fā)生少量交聯(lián)反應(yīng)。且黏度下降的原因有兩方面，一方面分解，另一方面重度交聯(lián)減少了明膠水溶液的濃度。明膠輻照后，其凝膠的熔化大于對照也與交聯(lián)有關(guān)：輻照后的明膠，其水溶解物中存在兩種體系，一是完全溶解部分，它來源于明膠大分子的降解，一是交聯(lián)產(chǎn)物，是不溶部分。這兩種體系對應(yīng)2個凝膠熔化峰溫，分解物在20℃左右，交聯(lián)物在40℃左右，由于交聯(lián)物很少，兩個峰沒有分開，但混合峰溫仍高于對照。

姚芳蓮等[14]研究認(rèn)為明膠的交聯(lián)產(chǎn)物交聯(lián)度越大，膜的抗張強(qiáng)度越大，而斷裂伸長率則下降。本研究發(fā)現(xiàn)，斷裂強(qiáng)度的增加和斷裂伸長率的下降卻主要來源于明膠輻照過程中的降解反應(yīng)。具體原因有待進(jìn)一步的研究來解釋。

4 結(jié)論

1）在有限水和無限氧氣存在下，明膠的輻射分解反應(yīng)是主要的，次要反應(yīng)是交聯(lián)。

2）輻照后明膠的黏度、凝膠強(qiáng)度、膠凝溫度、斷裂伸長率、分子質(zhì)量、大分子蛋白組分含量與劑量呈負(fù)相關(guān)，而斷裂強(qiáng)度、小分子多肽混合物含量和相對分子質(zhì)量分布寬度與劑量呈正相關(guān)。

3）在輻射劑量超過17.2kGy的情況下，不溶物含量遞增，熔化溫度較對照的高。

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