劉 俊 劉至治 王成輝 項(xiàng)松平 王 劍

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興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因多態(tài)性、表達(dá)及其與魚體抗病力關(guān)系的分析

劉 俊1劉至治1王成輝2項(xiàng)松平3王 劍3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 3. 浙江龍泉省級(jí)甌江彩鯉良種場(chǎng), 龍泉 323700)

對(duì)41尾感病和22尾抗病興國(guó)紅鯉的308個(gè)有效克隆進(jìn)行測(cè)序, 獲得171條不同的MHC Ⅱ類α基因編碼序列, 分屬26個(gè)不同的等位基因, 其中Cyca-DXA24—Cyca-DXA36為新發(fā)現(xiàn)的13個(gè)等位基因。MHCⅡ類α基因片段的長(zhǎng)度為624 bp, 包括第1—4個(gè)外顯子, 分別編碼信號(hào)肽、α1和α2結(jié)構(gòu)域及連接肽/跨膜區(qū)。α1結(jié)構(gòu)域的變異明顯大于α2結(jié)構(gòu)域, 表現(xiàn)在α1結(jié)構(gòu)域中核苷酸和氨基酸變異位點(diǎn)比例(55.16%和79.76%)明顯高于α2結(jié)構(gòu)域的變異位點(diǎn)比例(45.96%和68.42%)。α1結(jié)構(gòu)域的PBR區(qū)的非同義堿基替換率(N)與同義堿基替換率(S)的比值(=N/S)為5.742, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非抗原結(jié)合位點(diǎn)(non-PBR)及α2結(jié)構(gòu)域的0.755、0.592, 揭示興國(guó)紅鯉MHC Ⅱ類α基因的α1結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中受到正向選擇作用。等位基因Cyca-DXA24 (<0.01)與興國(guó)紅鯉對(duì)嗜水氣單胞菌的抗性相關(guān), 等位基因Cyca-DXA3 (<0.05)、Cyca-DXA4 (<0.01)、Cyca-DXA6 (<0.05)、Cyca-DXA33 (<0.05)與興國(guó)紅鯉對(duì)嗜水氣單胞菌的易感性相關(guān)。熒光定量PCR結(jié)果表明, MHCⅡ類α基因在健康興國(guó)紅鯉的腎、肝、鰓等10個(gè)組織均能普遍表達(dá)。人工感染嗜水氣單胞菌后, 腎、肝、脾3個(gè)組織中的MHCⅡ類α基因的表達(dá)量均發(fā)生了不同程度的變化, 表明MHCⅡ類α分子在興國(guó)紅鯉的免疫反應(yīng)中起到重要作用。

興國(guó)紅鯉; MHC; 多態(tài)性; 表達(dá); 抗病力

興國(guó)紅鯉(var.)為“江西三紅”之一, 其分布于江西省興國(guó)縣, 已有1300余年的養(yǎng)殖歷史[1]。據(jù)報(bào)道, 從1972—1984 年, 相關(guān)單位已對(duì)其進(jìn)行了6代定向選育, 培育出性狀穩(wěn)定的品種[2], 目前已選育至20代。興國(guó)紅鯉是重要的雜交親本, 在我國(guó)魚類雜交育種中具有重要作用。

在淡水養(yǎng)殖中, 嗜水氣單胞菌為主要病原菌之一, 目前沒(méi)有針對(duì)該菌的有效疫苗[3, 4]。因此, 有必要從綠色水產(chǎn)的角度出發(fā), 努力尋找一種安全的新方法, 增加魚體對(duì)嗜水氣單胞菌等病原菌的抵抗力。研究證明, 主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex, MHC)在魚類機(jī)體的免疫中發(fā)揮著極為重要的作用, 與許多疾病的抗性、易感性、免疫應(yīng)答都密切相關(guān), 已成為抗病力相關(guān)研究的重要候選基因[5—8]。本研究以興國(guó)紅鯉為對(duì)象, 人工感染嗜水氣單胞菌后, 分析MHCⅡ類α基因序列多態(tài)性與抗病力之間的關(guān)系, 同時(shí)采用熒光定量PCR技術(shù), 檢測(cè)健康魚體不同組織中MHCⅡ類α基因mRNA表達(dá)水平上的差異性, 并分析魚體感染嗜水氣單胞菌后, MHCⅡ類α基因在腎、肝、脾等組織中mRNA水平的變化。研究結(jié)果將為興國(guó)紅鯉抗病基因的篩選及抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2010年10月從江西省興國(guó)紅鯉良種場(chǎng)引入2 齡興國(guó)紅鯉, 養(yǎng)殖于浙江省龍泉省級(jí)甌江彩鯉良種場(chǎng)。2011年8月, 隨機(jī)選取健康魚(體重約601 g), 腹腔注射嗜水氣單胞菌(由上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)提供)進(jìn)行人工感染。具體方法: 實(shí)驗(yàn)組魚63尾, 每尾每100 g體重注射0.1 mL濃度為1.5×109cfu/mL的嗜水氣單胞菌; 對(duì)照組魚15尾, 每尾則注射相應(yīng)量的磷酸生理鹽水。13h后實(shí)驗(yàn)組魚開始死亡, 而對(duì)照組魚在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生長(zhǎng)正常, 無(wú)任何生病或死亡癥狀。這里, 感染96h后不出現(xiàn)發(fā)病癥狀的個(gè)體為抗病個(gè)體, 而96h內(nèi)出現(xiàn)口鰓出血、體表出血、皮膚潰瘍、游動(dòng)遲緩等癥狀且直至臨死的個(gè)體為感病個(gè)體。最終, 共得到41尾感病和22尾抗病個(gè)體。在感染過(guò)程中, 隨著感病個(gè)體的死亡, 及時(shí)取腎、肝、脾等組織, 迅速放入液氮中凍存, 轉(zhuǎn)至?80℃冰箱備用; 而抗病個(gè)體的相關(guān)組織, 則在感染完畢后采集。

1.2 方法

總RNA的提取和cDNA的合成 Trizol法提取實(shí)驗(yàn)魚腎中的總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性, 分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及OD值, 要求在1.8—2.0。以總RNA為模板, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript First Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)合成cDNA。

引物設(shè)計(jì), PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物的純化、克隆及測(cè)序 根據(jù)van Erp[9]已獲得的鯉MHCⅡ類α基因(GenBank登錄號(hào)為X95432), 設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物: DXAF (5′-TGCTTATGCTCGCTCTTATTGTC-3′)和DXAR (5′-ACCCACTCCACAAAACACAGCTG-3′) (由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成), 用于擴(kuò)增荷包紅鯉MHCⅡ類α基因的片段。PCR反應(yīng)總體積為25 μL, 包括: 1.0 μL cDNA (100 ng), 1.0 μL上、下游引物 (10 μmol/L), 2.0 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/mL), 2.5 μL 10×Buffer, 0.6 μLDNA聚合酶(Tiangen, 5 U/μL), 16.9 μL去離子水。PCR 程序如下: 94℃預(yù)變性3min; 94℃1min、54℃1min、72℃2min, 35 個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。所有PCR 反應(yīng)均在Mastercycler ep gradient S (Eppendorf)型PCR儀上進(jìn)行。

參照文獻(xiàn)[10]的方法, 進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化、目的片斷的連接和轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆的鑒定等操作。每尾個(gè)體隨機(jī)挑選5個(gè)陽(yáng)性克隆, 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的ABI3730測(cè)序儀測(cè)序。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分別在人工感染后12、24、48、72和96h 隨機(jī)選取3尾興國(guó)紅鯉, 取其腎、肝和脾組織, 以及對(duì)照組魚的10個(gè)組織(腦、眼、鰓、心臟、腸、腎、肝、肌肉、脾和胃)。提取各組織RNA, 選取高質(zhì)量且等量的RNA, 根據(jù)Prime ScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒附帶的說(shuō)明書, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)制備cDNA模板。PCR 反應(yīng)體系: 5× PrimeScript RT Master Mix 2 μL、500 ng RNA 最后加RNase Free dH2O 至10 μL。反應(yīng)條件: 37℃ 15min, 85℃ 5s, 4℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBR Premix ExTMⅡ(Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒, 反應(yīng)擴(kuò)增引物為DXA-ex-F (5′-AGGTGATGTGGTGCTGGGTG-3′)和DXA-ex-R (5′-AGCGAGGAGAAGATGTTGAAGG-3′), 產(chǎn)物長(zhǎng)度為171 bp。20 μL PCR 反應(yīng)體系為: 2 μL cDNA、10 μL SYBR Premix ExTMⅡ、0.4 μL ROXⅡ、0.8 μL上下游引物(10 μmol /L)和6.0 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性30s; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40個(gè)循環(huán); 60—95℃ 15min進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù), 空白對(duì)照采用ddH2O作為模板。目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線以腎組織的cDNA 10 倍系列(1.0 × 10–1、1.0 ×10–2、1.0 ×10–3、1.0 ×10–4、1.0 ×10–5倍)稀釋為模板得到, 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的特異性和試驗(yàn)的可靠性。反應(yīng)在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行。每個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)以內(nèi)參β-actin為參考基因, 引物序列: β-actin-ex-F (5′-TGCTATGTGGCTCTTGA- CTT-3′)和β-actin-ex-R (5′-CTGGGCACCTGAACCT- CT-3′), 產(chǎn)物長(zhǎng)度為127 bp。數(shù)據(jù)由7500PCR 儀自帶的軟件分析得到, 數(shù)據(jù)處理采用2–△△Ct法[11]。

MHCⅡ類α基因的命名與數(shù)據(jù)分析 已知鯉MHCⅡα有MHC-DXA一種基因型, 故興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因的命名參照文獻(xiàn)[10]中的方法進(jìn)行。

登錄NCBI, 用BLAST對(duì)所獲得的序列進(jìn)行同源檢索, 確定所得的基因片段。用Clustal X[12]對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)。利用MEGA 4.0[13]分析核苷酸序列和氨基酸序列的變異位點(diǎn), 確定等位基因, 計(jì)算核苷酸的錯(cuò)義和同義替換率、氨基酸的組成比例; 參照人類HLAⅡ類分子的晶體三維結(jié)構(gòu)[14], 對(duì)獲得的興國(guó)紅鯉MHCⅡ類基因序列的α1結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點(diǎn)(PBR)進(jìn)行界定, 然后用MEGA 4.0軟件中改進(jìn)的Nei-Gojobori (Jukes-Cantor)方法, 計(jì)算非同義堿基替換率(N)和同義堿基替換率(S)的比值(=N/S)。利用DnaSP 5.0[15]進(jìn)行第二外顯子和第三外顯子序列的多態(tài)性分析。

2 結(jié)果

2.1 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因序列測(cè)定

本研究對(duì)63尾興國(guó)紅鯉的308個(gè)有效克隆進(jìn)行了測(cè)序與分析。所得序列經(jīng)NCBI中BLAST同源比對(duì), 確認(rèn)為MHCⅡ類α基因片段。序列經(jīng)對(duì)位排列和變異檢測(cè)后, 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何插入、缺失或異常的密碼子。該核苷酸序列長(zhǎng)度為624 bp, 編碼11個(gè)氨基酸的部分信號(hào)肽、84個(gè)氨基酸的完整α1結(jié)構(gòu)域、95個(gè)氨基酸的完整α2結(jié)構(gòu)域和18個(gè)氨基酸的完整連接肽及部分跨膜區(qū), 共208個(gè)氨基酸。推斷的氨基酸序列經(jīng)比對(duì)后, 分屬26個(gè)不同的等位基因, 其中有13個(gè)等位基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的等位基因, 命名為Cyca-DXA24*01—Cyca-DAB36*01 (GenBank登陸號(hào)為KF154087-KF154099)。

2.2 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因多態(tài)性

分析表明, 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α的26個(gè)等位基因所包含的亞型數(shù)量多少不均。如等位基因Cyca-DXA24含有47個(gè)亞型, 頻率高達(dá)40.58%; 而Cyca-DXA19的亞型僅有1個(gè), 頻率為0.32%。此外, 各亞型的出現(xiàn)頻率高低不一。在總共171個(gè)亞型中, Cyca-DXA24*01出現(xiàn)的頻率最高, 為24.03%, 其次是Cyca-DXA4*01 (4.87%), 其余大多數(shù)亞型僅出現(xiàn)一次(0.32%)。值得注意的是, 我們發(fā)現(xiàn)單一個(gè)體中最多存在5個(gè)等位基因, 表明興國(guó)紅鯉個(gè)體中至少存在3個(gè)DXA基因座。

在所得的MHCⅡ類α基因核苷酸序列中, 分別檢測(cè)到297個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)和197個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。MHCⅡ類α基因的核苷酸變異位點(diǎn)比例為47.60%(297/624), 而氨基酸相對(duì)應(yīng)的值則高達(dá)69.23% (144/208) (表1)。MHCⅡα序列間的堿基及氨基酸變異范圍分別為0—9.6%和0—16.8%, 平均值為5.3%和9.5%。此外, α1結(jié)構(gòu)域的核苷酸/氨基酸位點(diǎn)變異率為55.16%/79.76%, 明顯大于α2結(jié)構(gòu)域的45.96%/68.42% (表1)。MHCⅡ類α 的信號(hào)肽、CP及TM變異都不大, 屬于保守序列。對(duì)全部序列的分析表明, 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因的單倍型多樣度(H)、核苷酸多樣度(P)及平均核苷酸差異數(shù)目()分別是0.9831、0.05332、33.275。

分析表明(表2), 在含有21個(gè)氨基酸位點(diǎn)的PBR區(qū)中, 變異位點(diǎn)數(shù)高達(dá)20個(gè)(95.24%), 而在non-PBR區(qū)的63個(gè)位點(diǎn)中, 變異位點(diǎn)數(shù)卻只有46個(gè)(73.01%), PBR區(qū)的變異率明顯高于non-PBR。計(jì)算表明, α1結(jié)構(gòu)域的PBR區(qū)的值為5.742遠(yuǎn)大于1, 而它們的non-PBR區(qū)(0.755)和α2結(jié)構(gòu)域(0.592)的值卻都小于1, 表明興國(guó)紅鯉MHCⅡα基因(尤其是α1結(jié)構(gòu)域)在進(jìn)化過(guò)程中受到正向選擇(Positive selection)作用。

2.3 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因與抗病力的關(guān)系

在所得的26個(gè)不同的MHCⅡ類α基因中(圖1), 其中有11個(gè)等位基因在感病群體和抗病群體中都出現(xiàn), 剩余的Cyca-DXA3、Cyca-DXA5、Cyca- DXA8、Cyca-DXA10、Cyca-DXA17、 Cyca-DXA19、Cyca-DXA20、Cyca-DXA22、Cyca-DXA30—Cyca- DXA36等15個(gè)等位基因則為感病群體所特有, 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)只存在于抗病群體的等位基因。等位基因Cyca-DXA3、Cyca-DXA33的頻率為9.00%和5.00%,顯著存在于感病群體中(<0.05); 等位基因Cyca- DXA4、Cyca-DXA6在感病群體中出現(xiàn)的頻率(27.00%、6.50%), 分別極顯著(<0.01)和顯著(<0.05)地高于抗病群體中出現(xiàn)的頻率(3.70%、0.93%); 等位基因Cyca-DXA24在抗病群體中出現(xiàn)的頻率(81.48%)極顯著(<0.01)高于感病群體中出現(xiàn)的頻率(18.50%)。

表 1 興國(guó)紅鯉核苷酸和氨基酸的變異位點(diǎn)

表2 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類基因α1結(jié)構(gòu)域的PBR、non-PBR及α2結(jié)構(gòu)域的dS和dN值

圖 1 不同等位基因在抗病群體與感病群體的分布頻率(%)

**< 0.01;*< 0.05

2.4 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因mRNA在組織中的表達(dá)

以興國(guó)紅鯉的腎cDNA為模板, 將模板做10倍梯度稀釋, 通過(guò)引物β-actin-ex-F、β-actin-ex-R 和DXA-ex-F、DXA-ex-R 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 制作內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)優(yōu)化, β-actin和MHCⅡ類α基因的擴(kuò)增效率分別為95.15%和96.18%, 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都為1, 斜率分別為–3.444和–3.417, 表明可以用2–△△法進(jìn)行相對(duì)定量分析。溶解曲線中沒(méi)有雜峰出現(xiàn), 未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增, 試驗(yàn)條件達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求, 可靠性較高。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的分析結(jié)果表明, 興國(guó)紅鯉的10 個(gè)組織中均擴(kuò)增出MHCⅡ類α 基因目的片段, 但表達(dá)量有所不同, 其中較強(qiáng)表達(dá)于腎、肝、鰓、腸、脾, 中等強(qiáng)度表達(dá)于心臟、胃、腦, 而在眼和肌肉中表達(dá)較弱(圖2A)。

人工感染嗜水氣單胞菌后的不同時(shí)期, 興國(guó)紅鯉腎、肝、脾這三個(gè)組織中的MHCⅡ類α 基因表達(dá)水平均發(fā)生了不同程度的變化(圖2B)。在腎組織中, MHCⅡ類α基因表達(dá)水平在12h表達(dá)水平最高, 接著發(fā)生下降, 在72h表達(dá)量最低, 呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。在肝和脾組織中, MHCⅡ類α基因表達(dá)水平都是先下降后上升的趨勢(shì), 96h之后恢復(fù)到原來(lái)的水平, 只是肝、脾組織中最低表達(dá)水平分別在感染后48h和24h。

圖 2 MHCⅡ類α 基因在健康(A)和感染(B)后興國(guó)紅鯉的各組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

MHC 是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域之一, 這主要表現(xiàn)為多基因座及每個(gè)基因座含有相當(dāng)數(shù)量的等位基因[10]。本研究發(fā)現(xiàn)每尾魚體中存在1—5個(gè)等位基因, 表明興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因至少含有3個(gè)基因座。這一結(jié)果與條紋鱸()[16]、大菱鲆()[17]、牙鲆()[18]等的研究結(jié)果不同, 這些魚類的個(gè)體中含有MHCⅡ類等位基因的數(shù)量最多不超過(guò)4個(gè), 推測(cè)至少含有2個(gè)基因座。而對(duì)于同是鯉的全紅體色甌江彩鯉(var.), 李雪松等[8]的報(bào)道推測(cè)單個(gè)個(gè)體中也是至少含有2個(gè)基因座?？梢? 魚類物種間含有MHC等位基因座的數(shù)量, 僅靠測(cè)序還無(wú)法確定, 需要設(shè)計(jì)核酸探針進(jìn)行原位雜交來(lái)驗(yàn)證。關(guān)于魚類MHCⅡ類α基因多態(tài)性的研究已有不少報(bào)道。Stet,.[19]從84尾大西洋鮭個(gè)體中檢測(cè)到7個(gè)等位基因; 徐田軍和陳松林[20]從45尾牙鲆個(gè)體得到129條序列, 共編碼30個(gè)等位基因; Pang,.[21]從6尾尼羅羅非魚()個(gè)體檢測(cè)到10個(gè)等位基因。本實(shí)驗(yàn)從63尾興國(guó)紅鯉中共得到26個(gè)不同的等位基因, 雖較牙鲆、尼羅羅非魚的多態(tài)性低, 卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大西洋鮭。不同魚類MHCⅡ類α基因的多態(tài)性高與低, 可能是該物種的故有特征, 或者是跟它們的生長(zhǎng)進(jìn)化史有關(guān), 如奠基者效應(yīng)、基因漂流、基因選擇等。

MHC是一個(gè)與抗病相關(guān)的基因家族, 不同的等位基因可能具有不同的抗病能力。作為抗病相關(guān)的分子標(biāo)記候選基因, MHC已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多地應(yīng)用于各種海、淡水魚類的抗病輔助育種的研究中。有關(guān)于MHCⅡ類α 基因與魚體抗病力之間關(guān)系的研究, 多集中于牙鲆[18]與大西洋鮭[26, 27]。Xu,.[18]在研究牙鲆MHCⅡ類α基因與鰻弧菌()抗病力的關(guān)系時(shí), 發(fā)現(xiàn)Paol-DAA* 1301、Paol-DAA*1401、Paol-DAA*2201與抗病性相關(guān), Paol-DAA*1001、Paol-DAA*1501與感病性相關(guān); Kj?glum,.[26]研究MHCⅠ類和MHCⅡ類聯(lián)合基因型與大西洋鮭癤病(Furunculosis)的抗病性的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)含有DAA*0301的魚抵抗力顯著強(qiáng)于DAA*0201的魚; Wynne,.[27]發(fā)現(xiàn), 含有Sasa-DAA-3'UTR中單倍型239/259和259/259的大西洋鮭, 對(duì)阿米巴鰓病的感染度明顯低于其他不含有該單倍性的個(gè)體。本研究在探討興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α 基因與嗜水氣單胞菌抗性的相關(guān)性時(shí), 獲得了5個(gè)與魚體抗病力相關(guān)的等位基因, 其中Cyca- DXA3、Cyca-DXA4、Cyca-DXA6、Cyca-DXA33與興國(guó)紅鯉對(duì)嗜水氣單胞菌的易感性相關(guān), 而Cyca- DXA24則與抗病性相關(guān)。雖然不能排除會(huì)有另外的連鎖基因可能導(dǎo)致本研究的結(jié)果, 但它們?yōu)楹Y選抗病相關(guān)MHCⅡ類α 基因標(biāo)記提供了重要的參考依據(jù)。

許多研究表明, 不同魚類的MHCⅡ類α基因的mRNA表達(dá)水平存在組織特異性。Srisapoome,.[28]檢測(cè)牙鲆的MHCⅡ類α基因在鰓、脾、腎、腸、胃中表達(dá)較高, 在肌肉和眼中表達(dá)較低; Li,.[29]的研究顯示, 在健康的圓斑星鰈()的腎、鰓、脾中表達(dá)量最高, 在肝、心臟和皮膚中度表達(dá), 在肌肉和腦中表達(dá)量最低。在本研究中, 興國(guó)紅鯉MHCⅡ類α基因的表達(dá)特異性, 與上述研究結(jié)果基本相符。腎和脾是最重要的免疫器官, 肝和黏膜上皮組織等也是重要的免疫防線, 而肌肉組織的免疫功能則是較低的?？梢? 魚類MHCⅡ類α基因在不同組織中表達(dá)量的高低與其免疫細(xì)胞的分布有關(guān), 揭示腎、肝、鰓、脾、腸等在魚類免疫過(guò)程中起重要作用。

致謝:

在感染實(shí)驗(yàn)及樣品采集過(guò)程中, 本院研究生畢祥、李雪松、趙雪錦、朱麗艷、胡建尊等同學(xué)提供了很多幫助, 在此表示衷心感謝。

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THE ANALYSIS OF THE POLYMORPHISM AND EXPRESSION OF MHC CLASSGENE AND ITS ASSOCIATION WITH RESISTANCE/SUSCEPTIBILITY TOIN XINGGUO RED COMMON CARP

LIU Jun1, LIU Zhi-Zhi1, WANG Cheng-Hui2, XIANG Song-Ping3and WANG Jian3

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China; 3. Oujiang Color Common Carp Provincial Farm, Longquan 323700, China)

We cloned 171 sequences of MHC class IIα gene were determined from 41 susceptible and 22 resistant individuals ofvar.. These sequences belonged to 26 alleles, thirteen of which were novel (Cyca-DXA24-Cyca-DXA36). The total length of the sequence was 624 bp, consisting of a 33 bp exon1, a 252 bp exon2, a 285 bp exon3, and a 54 bp exon4. These exons encoded a partial signal peptide, a α1 domain, a α2 domain and a connecting peptide (CP)/partial transmembrane (TM), respectively. The mutation-Prone positions of nucleotide or amino acid sites in α1 domain (55.16%, 79.76%) significantly out number than those in α2 domain (45.96%, 68.42%). Thevalues (=N/S) were 5.742 for peptide-binding region (PBR), 0.755 for non-PBR in the α1 domain and 0.592 for the α2 domain, implying that the positive selection pressure probably had occurred in the PBR region of the α1 domain. Cyca-DXA24 (<0.01) was significantly correlated with the carp’s resistance to, while Cyca-DXA3 (<0.05), Cyca-DXA4 (<0.01), Cyca-DXA6 (<0.05) and Cyca-DXA33 (<0.05) alleles were significantly associated with the fish’s susceptibility to the disease. Real-time quantitative PCR demonstrated that MHC IIα genes were ubiquitously expressed in ten tissues. The expression was up-regulated in kidney, down-regulated in liver and spleen during infection. Our results indicated that the MHC class IIα gene might play an important role in the immune reactions ofvar..

var.; MHC; Polymorphism; Expression; Disease resistance

2013-08-09;

2013-11-02

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200903045); 上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新基金(11YZ152); 上海高校水產(chǎn)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助

劉俊(1987—), 女, 河南信陽(yáng)人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)轸~類分子進(jìn)化與免疫遺傳學(xué)。E-mail: liujunhnsd@126.com

劉至治, E-mail: zzliu@shou.edu.cn; 王成輝, E-mail: wangch@shou.edu.cn

Q346+.5

A

1000-3207(2014)02-0241-08

10.7541/2014.36