李紅喜，陳新會，康戰(zhàn)芳，陳秋紅

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天竺桂葉片抗寒性生理生化指標(biāo)測定及綜合評價(jià)

李紅喜，陳新會，康戰(zhàn)芳，陳秋紅

（欒川縣林業(yè)局，河南 欒川 471500）

通過低溫脅迫實(shí)驗(yàn)，對河南欒川和湖北襄陽天竺桂葉片的含水量、相對含水量、脯氨酸含量、葉綠素含量、細(xì)胞膜透性、MDA含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、CAT活性、APX活性等生理生化指標(biāo)測定。綜合各項(xiàng)指標(biāo)表明河南欒川天竺桂葉片耐受低溫為-20℃，湖北襄陽天竺桂葉片耐受低溫為-16℃。

天竺桂；抗寒性；生理生化測定；評價(jià)

天竺桂屬于亞熱帶植物，志書記載均分布在伏牛山南坡以南的亞熱帶地區(qū)，伏牛山北坡暖溫帶地區(qū)沒有分布[1]。2004年，通過對暖溫帶地區(qū)伏牛山北坡調(diào)查，天竺桂野生資源在欒川縣老君山自然保護(hù)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，2005年在欒川縣龍峪灣國家森林公園發(fā)現(xiàn)小型群落，2010年在欒川縣潭頭鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)原生群落，最大直徑28 cm。野生天竺桂在欒川的發(fā)現(xiàn)，突破了常規(guī)栽培的北限，擴(kuò)大了天竺桂的栽培范圍，改變了天竺桂只能南方栽培的格局，這為天竺桂在北方栽培和綠化，提供了前所未有的契機(jī)，具有重大的科研價(jià)值和市場空間[2]。

目前國內(nèi)對天竺桂引種適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)和生理生化機(jī)制研究較少，為了對天竺桂的引種提供有價(jià)值的參考，并通過天竺桂抗寒生理生化研究，為天竺桂引種馴化及繁育開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。2013年1月，在河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室對河南欒川天竺桂和湖北襄陽天竺桂進(jìn)行抗寒生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 植物材料

為湖北襄陽天竺桂和河南欒川天竺桂葉片。采集地點(diǎn)：河南省欒川縣苗圃。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

1.2.1試驗(yàn)試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、核黃素、甲硫氨酸、EDTA-Na2、氯化硝基四挫藍(lán)、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、L-抗壞血酸鈉、過氧化氫、可溶性聚乙烯吡咯烷酮、考馬斯亮藍(lán)-G250、冰醋酸、磷酸、無水乙醇、3%磺基水楊酸、冰乙酸、酸性茚三酮、甲苯。

1.2.2試驗(yàn)儀器

BL-610分析天平和BS-200S型分析天平、pHS-3型數(shù)顯酸度計(jì)、3K18臺式高速冷凍離心機(jī)、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋、TU-1810紫外可見分光光度計(jì)、2XZ-1型真空泵、DZG-6090型真空干燥箱、78-1型磁力加熱攪拌器、Sigma移液槍、TYS-3N葉綠素檢測儀、DDS-307型電導(dǎo)率儀、BCD-28EMC型冷藏冷凍箱。

1.3 試驗(yàn)方法

對所采集的天竺桂枝葉用保鮮箱送至實(shí)驗(yàn)室，放置于低溫程序控制冰箱中，模擬自然條件下的低溫狀況，溫度分別設(shè)置為4℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃，室溫CK作為對照。低溫程序控制冰箱每10 min下降1℃，到所需的溫度后放置24 h，然后取出部分樣品放置于室溫下15 h后進(jìn)行測定。剩下的樣品繼續(xù)按設(shè)定梯度處理。

1.3.1葉片含水量的測定

取低溫脅迫的天竺桂葉片，每個(gè)溫度為一組，隨機(jī)取2~3片葉，稱重并記錄；然后將葉片放入盛有自來水的培養(yǎng)皿中，室溫放置8 h，取出稱重記錄；將葉片用報(bào)紙包裹并標(biāo)記，在電熱恒溫干燥箱中80℃烘12 h后稱干重并記錄。

1.3.2游離脯氨酸含量測定

取不同處理的剪碎混勻天竺桂葉片0.4 g，分別置于大試管中，加入5 ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。取出試管冷卻后，吸取上清液2 ml，加2 ml冰乙酸和3 ml顯色液，于沸水水浴中加熱40 min，下一步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行甲苯萃取和比色，記錄吸光值。

1.3.3葉綠素含量測定

隨機(jī)選取5~6片低溫脅迫的葉片，用手持葉綠素檢測儀對葉片不同部位進(jìn)行葉綠素含量測定并記錄。

SOD、APX、CAT酶活性及MDA、可溶性蛋白質(zhì)含量和相對電導(dǎo)率大小測定參考趙世杰等、葉寶興方法[3-4]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

MierosoftExel作圖；SPSS13.0做統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

低溫脅迫下，湖北襄陽天竺桂和河南欒川天竺桂葉片的含水量和相對含水量、脯氨酸含量、葉綠素含量、細(xì)胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、過氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性等生理生化變化情況如圖1~8。

圖1 天竺桂葉片細(xì)胞膜透性變化

圖2 天竺桂葉片脯氨酸含量變化

圖3 天竺桂葉片葉綠素含量變化

圖4 天竺桂葉片可溶性蛋白含量變化

圖5 天竺桂葉片丙二醛（MDA）含量變化

圖6 天竺桂葉片過氧化氫酶（CAT)含量變化

圖7 天竺桂葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

圖8 天竺桂葉片過氧化物酶（APX）含量變化

3 小結(jié)

植物對低溫脅迫的響應(yīng)是積極主動的應(yīng)激過程，低溫誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)[5]?？购灾钢参锊皇軆龊λ苋棠偷谋鶅鰷囟萚6]。環(huán)境脅迫下植物的抗性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理、生化、生態(tài)過程，并且各種生理生化反應(yīng)之間相互影響、相互作用。由于植物的抗寒性是受多種因素的影響而形成的，它涉及到植物的組織結(jié)構(gòu)功能和一系列生理生化問題。通過低溫脅迫實(shí)驗(yàn)，測定了包括葉片含水量和相對含水量、脯氨酸含量、葉綠素含量、細(xì)胞膜透性、MDA含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、CAT活性、APX活性等生理生化指標(biāo)，進(jìn)一步分析了不同地區(qū)天竺桂抗寒性與每一種指標(biāo)之間的關(guān)系。通過這項(xiàng)指標(biāo)可以看出，河南欒川天竺桂抗寒性高于湖北襄陽天竺桂。

在遇到低溫傷害時(shí)，湖北襄陽天竺桂葉片比河南欒川天竺桂葉片細(xì)胞膜透性變化要大。在透性達(dá)到最大值的低溫溫度上，湖北襄陽天竺桂抗性是-16℃，河南欒川天竺桂是-20℃。按照細(xì)胞膜透性越大，則其抗性越小的理論，湖北襄陽天竺桂抗寒性不如河南欒川天竺桂。

在低溫脅迫過程中，當(dāng)?shù)蜏亟抵?20℃時(shí)，MDA含量變化出現(xiàn)兩種情況，河南欒川天竺桂MDA含量上升，湖北襄陽天竺桂MDA含量下降，表明在-20℃時(shí)河南欒川天竺桂葉片受害持續(xù)，還有生命特征，湖北襄陽天竺桂葉片基本死亡，基本沒有生命特征。同時(shí)，在低溫脅迫過程中，河南欒川天竺桂和湖北襄陽天竺桂相比，其MDA含量較低，變化幅度較小，說明河南欒川天竺桂抗寒性大于湖北襄陽天竺桂，這與蘋果砧木低溫脅迫研究得出的結(jié)果一致[7]。

在低溫脅迫過程中，不同地區(qū)天竺桂酶促清除系統(tǒng)反應(yīng)不同，酶促清除系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)等[107]。河南欒川天竺桂葉片在溫度降至4℃時(shí)，SOD、CAT、APX活性全部啟動，協(xié)同抵御不良環(huán)境；隨著溫度下降，SOD和CAT活性最先降低（-4℃），最后是APX（-8℃）；接著CAT活性被再次激活（-8℃），其次SOD活性也被激活（-12℃），最后是APX（-16℃）；到-16℃時(shí)SOD、APX活性被繼續(xù)激活，CAT活性下降；到-20℃時(shí)只有SOD活性被繼續(xù)激活，CAT、APX活性下降，表明河南欒川天竺桂自身生理機(jī)能較差，自身抗性降到較低水平。湖北襄陽天竺桂葉片在溫度降至4℃時(shí)，APX和CAT活性最先降低（-4℃），SOD活性慢慢喚醒；隨著溫度下降，APX活性被喚醒（-4℃），到-8℃CAT活性才被激活，表明在遇到低溫危害時(shí)，湖北襄陽天竺桂自身反應(yīng)機(jī)制較慢；在低溫降到-16℃時(shí)，APX活性急速下降，CAT活性急速上升，SOD活性在也-12℃以下變化不大；到-20℃時(shí)只有CAT活性被繼續(xù)激活，SOD、APX活性下降，表明湖北襄陽天竺桂自身生理機(jī)能較差，自身抗性降到較低水平。從低溫脅迫過程不同地區(qū)天竺桂酶促清除系統(tǒng)活性對比可以看出，SOD活性相近，CAT、APX活性相比河南欒川天竺桂均低于湖北襄陽天竺桂，酶促清除系統(tǒng)是由于膜脂過氧化作用變化而變化的，這表明在抵御細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化過程中，河南欒川天竺桂均自身調(diào)節(jié)、回避機(jī)制高于湖北襄陽天竺桂，也就是說河南欒川天竺桂自身的適應(yīng)能力大于湖北襄陽天竺桂，使得在低溫脅迫下，河南欒川天竺桂對不良環(huán)境的反應(yīng)小于湖北襄陽天竺桂。

河南欒川天竺桂葉片含水量均低于湖北襄陽天竺桂，表明河南欒川天竺桂在自然適應(yīng)過程中，通過降低葉片含水量來抵御低溫危害；在葉片相對含水量對比試驗(yàn)中，河南欒川天竺桂自由水/束縛水變化比湖北襄陽天竺桂反應(yīng)較慢，變化幅度較小。游離脯氨酸含量、可溶性蛋白、葉綠素含量變化也能說明這一現(xiàn)象，通過兩個(gè)地區(qū)天竺桂葉片對低溫反應(yīng)過程中游離普氨酸、可溶性蛋白、葉綠素含量變化相比，湖北襄陽天竺桂變化較大、含量較高、反應(yīng)敏感，河南欒川天竺桂變化較小、含量較底、反應(yīng)不太敏感，也表明了河南欒川天竺桂抗寒性高于湖北襄陽天竺桂，同時(shí)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與樹種原生地極端最低氣溫和引種試驗(yàn)田間觀察結(jié)果一致。

綜合各項(xiàng)指標(biāo)表明河南欒川天竺桂葉片耐受低溫為-20℃，湖北省襄陽天竺桂葉片耐受低溫為-16℃。

4 問題與討論

由于不同溫度處理是在低溫程序控制冰箱中進(jìn)行，相對于田間來說，其降溫速度、恒定時(shí)間于田間有很大差異，所以通過自然降溫不同時(shí)段采集的實(shí)驗(yàn)材料更能反映數(shù)據(jù)的真實(shí)性。

本次抗寒性試驗(yàn)僅采集天竺桂葉片進(jìn)行試驗(yàn)，天竺桂小枝、根部低溫、水分、鹽分脅迫尚未進(jìn)行，有待進(jìn)一步研究。

由于此次進(jìn)行抗寒生理生化測定所使用的葉片為離體葉片，于樹體葉片存在差異，也影響了數(shù)據(jù)的可信程度，今后將利用自然降溫過程采摘樹體葉片進(jìn)行試驗(yàn)以獲取最真實(shí)的數(shù)據(jù)。

[1]丁寶章，王遂義．河南植物志第2冊[M]. 鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，1981.

[2]魏振鐸．欒川縣野生天竺桂資源保護(hù)初探[J]．河南林業(yè)科技，2010（02）：26-27．

[3] 趙世杰，史國安，董新純，等. 植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[4] 葉寶興，朱新產(chǎn). 生物科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[5] THOMASHOW M F. Sowhats new in the field of plant cold acclin ationLots[ J]．Plant Physio，2001，125：89-93．

[6] GLERUM C. Frost hardiness of coniferous seed lings p rinciples and appli cations[M] / DURYEA M L. Evaluating seedl ing quality.princip les，procedures, and predictive abilities of major tests. Corvall is, OR：Forest Reasearch Laborary，Oregon State University, 1985: 107-123．

[7]趙玲玲，宋來慶，劉志，等．低溫脅迫下4種蘋果砧木葉片多胺的變化[J]．果樹學(xué)報(bào)，2008，25（2）：151-156．

2014-10-31

S 685.15

A

1003-2630（2014）04-0026-04

（責(zé)任編輯：王團(tuán)榮）