蘇秋鈺　方傳雷　曹羊等

摘要

[目的]對(duì)水曲柳節(jié)律相關(guān)GIGANTEA基因的克隆及同源性進(jìn)行比對(duì)分析。[方法]根據(jù)GenBank中GI基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行PCR分析，并與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。[結(jié)果]獲得了編碼區(qū)780 bp的部分序列，可以編碼260個(gè)氨基酸，獲得的GI基因命名為FmGI，與多個(gè)物種GI基因有著較高的同源性，其中與葡萄、大豆、苜蓿、毛果楊、蓖麻、黃瓜、菊花、大麥、玉米、小麥、擬南芥、黑麥草、洋蔥和云杉等多個(gè)物種具有較高一致性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，GI基因按照單子葉植物、雙子葉植物和裸子植物的進(jìn)化關(guān)系聚為3類，明確了水曲柳GI基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。[結(jié)論]該方法對(duì)水曲柳生物節(jié)律鐘GI基因編碼區(qū)進(jìn)行了克隆，并對(duì)獲得的部分GI蛋白序列進(jìn)行了同源性比對(duì)分析，建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹，為進(jìn)一步獲得水曲柳GI基因全長(zhǎng)及研究其功能起到一定參考作用。

關(guān)鍵詞 水曲柳（Fraxinus mandshurica）；GIGANTEA；生物節(jié)律；光周期；同源性分析；系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào) S792.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02297-04

Cloning and Homology Analysis of Biological Rhythms Related GIGANTEA Gene in Fraxinus mandshurica

SU Qiuyu， ZENG Fansuo et al

（College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To comparatively analyze cloning and homology of biological rhythms related GIGANTEA gene in Fraxinus mandshurica. [Method] Using degenerate primers corresponding to conserved domains of GI gene in GenBank， PCR analysis was conducted， as well as homology analysis with amino acid sequence of other species. [Result] The length of the fragment obtained was 780bp， ORF predicted the protein was component of 260 amino acids. The homology analysis， of the obtained fragment showed that， it had a high consistency with Vitis vinifera， Glycine max， Medicago truncatula， Populus trichocarpa， Ricinus communis， Cucumis

sativu， Chrysanthemum seticuspe， Hordeum vulgare， Zea mays， Triticum aestivum， Arabidopsis thaliana， Lolium perenn， Allium cepaand， and Picea abies. Phylogenetic analysis showed that according to monocots， dicots and gymnosperms， the evolutionary relationship of GI gene clustered into three categories. The obtained GI gene clustered with dicots， it showed a clear phylogenetic relationship of GI gene in Fraxinus mandshurica. [Conclusion] The study provide a reference for further obtaining Fraxinus mandshurica GI gene full length and researching its functions.

Key words Fraxinus mandshurica； GIGANTEA； Biological rhythms； Photoperiod； Homology analysis； Phylogenetic tree

生物能夠通過(guò)不斷調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)和發(fā)育狀態(tài)以適應(yīng)季節(jié)與環(huán)境變化。許多物種通過(guò)光周期來(lái)識(shí)別不同季節(jié)[1]。高等植物可以感受不同季節(jié)晝長(zhǎng)的振蕩變化，并調(diào)節(jié)啟動(dòng)開花進(jìn)程的時(shí)間。這是環(huán)境信號(hào)和節(jié)律基因參與時(shí)間調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜的相互作用結(jié)果[2]。生物節(jié)律基因GIGANTEA（GI）是生物鐘的重要組件，在多種植物開花時(shí)間調(diào)控中起作用[3-8]。模式生物擬南芥的研究表明，GI基因的功能是在春季和夏季等長(zhǎng)日照通路中啟動(dòng)開花[9-10]。gigantea（gi）和constans（co）等基因介導(dǎo)了擬南芥光周期調(diào)控通路，即其在長(zhǎng)日照條件（LD）下響應(yīng)并促進(jìn)開花過(guò)程[11-12]。長(zhǎng)日照中，生物鐘（內(nèi)部計(jì)時(shí)器，調(diào)控24 h的植物節(jié)律）和節(jié)律調(diào)控開花時(shí)間基因與感受器的互作過(guò)程中，促進(jìn)了CO蛋白的積累，隨后轉(zhuǎn)錄激活開花整合基因FLOWERING LOCUS T（FT）來(lái)啟動(dòng)開花進(jìn)程。并且，GI基因還受到生物節(jié)律鐘的調(diào)控。

生物鐘是生物內(nèi)部24 h的振蕩器，調(diào)節(jié)每天的節(jié)律[13-17]。研究表明，GI的表達(dá)也受到節(jié)律基因調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄水平在日出8～10 h后達(dá)到峰值。出峰時(shí)間、峰高和持續(xù)時(shí)間受到日照長(zhǎng)度的影響。并且GI可以與LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和EARLY FLOWERING 3 （ELF3）基因相互作用，在光周期啟動(dòng)的開花過(guò)程中，對(duì)開花時(shí)間相關(guān)基因起到重要調(diào)控作用[8-9]。此外，GI通過(guò)miR172調(diào)控一個(gè)與CO基因獨(dú)立的通路，并調(diào)控開花過(guò)程[18]。對(duì)于GI突變體的研究表明，GI基因在不同的生物進(jìn)程中起著多效作用[19-20]。擬南芥GI基因翻譯后的蛋白預(yù)測(cè)為1 173個(gè)氨基酸，分子量為127 kDa[8-9]。與GI基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)相似，白天GI蛋白水平也呈周期性變化，在日出12 h達(dá)到峰值；在夜間，GI與E3泛素連接酶CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 （COP1）和時(shí)鐘相關(guān)ELF3形成了一個(gè)復(fù)合物，這個(gè)過(guò)程導(dǎo)致了黑暗中GI蛋白含量的下降[21]。

水曲柳（Fraxinus mandshurica）為木犀科白蠟屬（Fraxinus）植物，樹高可達(dá)30 m，胸徑可達(dá)60 cm以上，是東北林區(qū)的主要造林樹種。水曲柳是東北3大珍貴硬闊葉用材樹種之一，是闊葉樹種中適應(yīng)性較強(qiáng)、生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的優(yōu)良珍貴樹種[22]。筆者以水曲柳為材料，根據(jù)GenBank中GI基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR，克隆GI基因部分編碼區(qū)序列，分析水曲柳GI基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期為深入研究水曲柳GI基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。水曲柳（Fraxinus mandschurica），取材于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，取水曲柳新鮮葉片，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2

主要試劑。Primer star Taq酶、凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、JM109感受態(tài)細(xì)胞和pMD18-T載體，均購(gòu)自于寶生物工程（大連）有限公司；擴(kuò)增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1

水曲柳GI基因編碼區(qū)片段的克隆。以水曲柳幼嫩葉片作為材料，應(yīng)用CTAB法提取總RNA。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。根據(jù)已發(fā)表的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、車前草（Plantago）、黑麥草（Lolium perenne）、菊花（Chrysanthemum）、歐洲山楊（Populus tremula）的GI核苷酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（表1），以水曲柳cDNA為模板，對(duì)GI基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。應(yīng)用凝膠回收試劑盒對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.2

水曲柳GI基因的同源性比對(duì)分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast以及PRALINE等在線分析軟件，對(duì)GI基因序列以及推測(cè)的編碼蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì)，搜索不同物種中的同源基因及蛋白。根據(jù)李軍等推薦的軟件組合[23]，先采用ClustalX將氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)的分析，然后利用MEGA 5.0 軟件，算法為NeighborJoining，自檢舉1 000次，構(gòu)建進(jìn)化樹[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水曲柳總RNA的提取

圖1表明，在提取過(guò)程中并未出現(xiàn)降解。利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度檢測(cè)，RNA樣品的OD260/OD280均在1.9～2.0，純度較高，能夠用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

圖1 水曲柳總RNA的提取

2.2 水曲柳GI基因編碼區(qū)片段的獲得

圖2表明，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化JM l09感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。獲得的水曲柳GI基因的cDNA片段應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，推測(cè)的氨基酸序列如圖3所示。

圖2 簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜

圖3 水曲柳GI 基因cDNA序列及其推測(cè)的氨基酸序列

2.3 水曲柳GI基因編碼區(qū)片段的同源性分析

克隆后測(cè)序的結(jié)果應(yīng)用NCBI網(wǎng)站（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）BlastN和BlastX程序進(jìn)行了序列和功能同源性比對(duì)分析。BlastX分析結(jié)果表明，獲得的GI基因編碼區(qū)部分片段與多個(gè)物種GI基因氨基酸序列同源，其中與葡萄（Vitis vinifera，XP_002264755.1）、大豆（Glycine max，BAJ22595.1）、苜蓿（Medicago truncatula，XP_003592047.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002307516.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002524341.1）、黃瓜（Cucumis sativus，XP_004163795.1）、菊花（Chrysanthemum seticuspe，BAM67030.1）、大麥（Hordeum vulgare，AAL08497.2）、玉米（Zea mays，AFW80282.1）、小麥（Triticum aestivum，AAT79487.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，ABP96483.1）、黑麥草（Lolium perenne，CAY26028.1）、洋蔥（Allium cepa，ACT22764.1）和云杉（Picea abies，AGH20049.1）的一致性分別為69%、69%、67%、70%、68%、68%、68%、61%、59%、61%，64%、59%、59%和48%。

應(yīng)用PRALINE（http：//www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）在線多序列比對(duì)軟件分析對(duì)不同物種GI蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖4）。結(jié)果顯示，試驗(yàn)獲得的GI蛋白序列，與葡萄、大豆、苜蓿、毛果楊、蓖麻、黃瓜、菊花、大麥、玉米、小麥、擬南芥、黑麥草、洋蔥和云杉等物種GI蛋白序列相比具有很高的保守性。

2.4 水曲柳GI基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

系統(tǒng)進(jìn)化樹是物種的進(jìn)化史，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以根據(jù)這些物種的祖先描述它們的進(jìn)化關(guān)系。先采用ClustalX對(duì)14個(gè)物種的GI基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)的分析，其中包括葡萄（Vitis vinifera，XP_002264755.1）、大豆（Glycine max，BAJ22595.1）、苜蓿（Medicago truncatula，XP_003592047.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002307516.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002524341.1）、黃瓜（Cucumis sativus，XP_004163795.1）、菊花（Chrysanthemum seticuspe，BAM67030.1）、大麥（Hordeum vulgare，AAL08497.2）、玉米（Zea mays，AFW80282.1）、小麥（Triticum aestivum，AAT79487.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，ABP96483.1）、黑麥草（Lolium perenne，CAY26028.1）、洋蔥（Allium cepa，ACT22764.1）和云杉（Picea abies，AGH20049.1），然后利用MEGA 5.0 軟件，算法為Neighbor-Joining構(gòu)建進(jìn)化樹。圖5表明，從遺傳距離上看，這些物種的GI基因的親緣關(guān)系都比較接近，主要聚為3大類，其中被子植物中，雙子葉植物毛果楊、蓖麻、葡萄、黃瓜、大豆、苜蓿、菊花、擬南芥和水曲柳聚為1類，單子葉植物洋蔥、玉米、黑麥草、大麥和小麥聚為1類；裸子植物云杉單獨(dú)聚為1類。

3 結(jié)論與討論

植物生物節(jié)律鐘基因的研究越來(lái)越受到研究者的重視。例如，節(jié)律基因LHY/CCA1和TCO1基因參與了生物節(jié)律鐘中心振蕩器的負(fù)反饋調(diào)節(jié)循環(huán)。此外，開花時(shí)間通路的分析表明，生物節(jié)律鐘的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用與光的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用一起可以激活響應(yīng)晝長(zhǎng)并調(diào)控開花時(shí)間的蛋白[2]。擬南芥GI基因是光周期開花通路中的核心組件。編碼蛋白定位于細(xì)胞核，是植物特異性蛋白，在CO基因上游起作用。GI的mRNA上下的振動(dòng)受到晝夜節(jié)律的調(diào)控，在日出8～10 h后含量達(dá)到峰值，但是GI基因同時(shí)會(huì)反饋調(diào)節(jié)生物鐘，維持晝夜的正常節(jié)律。擬南芥gi突變體中CO基因的表達(dá)下降了，而GI基因的過(guò)表達(dá)可以增加CO的mRNA表達(dá)水平，并可以促進(jìn)植物在短日照（SD）條件下開花。gi突變體的在連續(xù)光照或黑暗下，其常規(guī)晝夜節(jié)律會(huì)被擾亂，并且延遲起作用[25-26]。

試驗(yàn)利用GenBank上已發(fā)表的GIGANTEA（GI）基因的氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)水曲柳GI基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了編碼區(qū)780 bp的部分序列。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)其可以編碼260個(gè)氨基酸。獲得的GI基因序列與多個(gè)物種GI基因有著較高的同源性，其中與葡萄、大豆、苜蓿、毛果楊、蓖麻、黃瓜、菊花、大麥、玉米、小麥、擬南芥、黑麥草、洋蔥和云杉等一致性分別為69%、69%、67%、70%、68%、68%、68%、61%、59%、61%，64%、59%、59%和48%。對(duì)其氨基酸序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，獲得的GI蛋白序列與其他物種的同源性也較高。進(jìn)化樹的結(jié)果表明，GI蛋白家族保守性較高，大體按照單子葉植物、雙子葉植物和裸子植物的進(jìn)化關(guān)系分為3類。試驗(yàn)獲得的水曲柳GI部分氨基酸序列，也與雙子葉植物毛果楊、蓖麻、葡萄、黃瓜、大豆、苜蓿、菊花和擬南芥聚為一類，符合進(jìn)化關(guān)系。

試驗(yàn)對(duì)水曲柳生物節(jié)律鐘GI基因編碼區(qū)進(jìn)行了克隆，并對(duì)獲得的部分GI蛋白序列進(jìn)行了同源性比對(duì)分析，建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)進(jìn)一步獲得水曲柳GI基因全長(zhǎng)及研究其功能起到一定參考作用。

參考文獻(xiàn)

[1]

SAUNDERS D S.An Introduction to Biological Rhythms[M].Glasgow and London：Blackie and Son Ltd，1977.

[2] HAYAMA R，COUPLAND G.Shedding light on the circadian clock and the photoperiodic control of flowering[J].Current Opinion in Plant Biology，2003，6（1）：13-19.

[3] KIM Y，LIM J，YEOM M，et al.ELF4 Regulates GIGANTEA Chromatin Access through Subnuclear Sequestration[J].Cell Reports，2013，3（3）：671-677.

[4] BLACK M M，STOCKUM C，DICKSON J M，et al.Expression，purification and characterisation of GIGANTEA：A circadian clock-controlled regulator of photoperiodic flowering in plants[J].Protein Expression and Purification，2011，76（2）：197-204.

[5] KOORNNEEF M，HANHART C J，VAN DER VEEN J H.A genetic and physiological analysis of late flowering mutants in Arabidopsis thaliana[J].Molecular and General Genetics MGG，1991，229（1）：57-66.

[6] RDEI G P.Supervital mutants of Arabidopsis[J].Genetics，1962，47（4）：443.

[7] OLIVERIO K A，CREPY M，MARTIN-TRYON E L，et al.GIGANTEA regulates phytochrome A-mediated photomorphogenesis independently of its role in the circadian clock[J].Plant Physiology，2007，144（1）：495-502.

[8] PARK D H，SOMERS D E，KIM Y S，et al.Control of circadian rhythms and photoperiodic flowering by the Arabidopsis GIGANTEA gene[J].Science，1999，285（5433）：1579-1582.

[9] FOWLER S，LEE K，ONOUCHI H，et al.GIGANTEA：a circadian clock-controlled gene that regulates photoperiodic flowering in Arabidopsis and encodes a protein with several possible membrane-spanning domains[J].The EMBO Journal，1999，18（17）：4679-4688.

[10] BLACK M M，STOCKUM C，DICKSON J M，et al.Expression，purification and characterisation of GIGANTEA：A circadian clock-controlled regulator of photoperiodic flowering in plants[J].Protein Expression and Purification，2011，76（2）：197-204.

[11] SEARLE I，COUPLAND G.Induction of flowering by seasonal changes in photoperiod[J].The EMBO Journal，2004，23（6）：1217-1222.

[12] DAVID K M，ARMBRUSTER U，TAMA N，et al.Arabidopsis GIGANTEA protein is post-transcriptionally regulated by light and dark[J].FEBS letters，2006，580（5）：1193-1197.

[13] SUREZ-LPEZ P，WHEATLEY K，ROBSON F，et al.CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis[J].Nature，2001，410（6832）：1116-1120.

[14] YANOVSKY M J，KAY S A.Molecular basis of seasonal time measurement in Arabidopsis[J].Nature，2002，419（6904）：308-312.

[15] IMAIZUMI T，TRAN H G，SWARTZ T E，et al.FKF1 is essential for photoperiodic-specific light signalling in Arabidopsis[J].Nature，2003，426（6964）：302-306.

[16] IMAIZUMI T，SCHULTZ T F，HARMON F G，et al.FKF1 F-box protein mediates cyclic degradation of a repressor of CONSTANS in Arabidopsis[J].Science，2005，309（5732）：293-297.

[17] VALVERDE F，MOURADOV A，SOPPE W，et al.Photoreceptor regulation of CONSTANS protein in photoperiodic flowering[J].Science，2004，303（5660）：1003-1006.

[18] JUNG J H，SEO Y H，SEO P J，et al.The GIGANTEA-regulated microRNA172 mediates photoperiodic flowering independent of CONSTANS in Arabidopsis[J].The Plant Cell Online，2007，19（9）：2736-2748.

[19] MIZOGUCHI T，WRIGHT L，F(xiàn)UJIWARA S，et al.Distinct roles of GIGANTEA in promoting flowering and regulating circadian rhythms in Arabidopsis[J].The Plant Cell Online，2005，17（8）：2255-2270.

[20] MARTINTRYON E L，KREPS J A，HARMER S L.GIGANTEA acts in blue light signaling and has biochemically separable roles in circadian clock and flowering time regulation[J].Plant Physiology，2007，143（1）：473-486.

[21] YU J W，RUBIO V，LEE N Y，et al.COP1 and ELF3 control circadian function and photoperiodic flowering by regulating GI stability[J].Molecular Cell，2008，32（5）：617-630.

[22] 曾凡鎖，梁楠松，王璇，等.水曲柳結(jié)構(gòu)域重新甲基化酶DRM基因片段的克隆及同源性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（24）：9934-9937.

[23] 李軍，張莉娜，溫珍昌.生物軟件選擇與使用指南[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：80.

[24] TAMURA K，DUDLEY J，NEI M，et al.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[25] HUQ E，TEPPERMAN J M，QUAIL P H.GIGANTEA is a nuclear protein involved in phytochrome signaling in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2000，97（17）：9789-9794.

[26] TSENG T S，SALOM P A，MCCLUNG C R，et al.SPINDLY and GIGANTEA interact and act in Arabidopsis thaliana pathways involved in light responses，flowering，and rhythms in cotyledon movements[J].The Plant Cell Online，2004，16（6）：1550-1563.