郭彥濤 楊少鋒 鄧博

摘要：目的：探討金剛健骨片對成骨細胞增殖分化及堿性磷酸酶表達的影響,為補腎填精藥物治療骨質(zhì)疏松提供可靠的實驗依據(jù)。方法：采用中藥血清藥理學(xué)方法制備補腎填精中藥含藥大鼠血清；用多次酶消化法體外培養(yǎng)成骨細胞；將不同實驗組補腎填精中藥含藥血清分別加入新生大鼠成骨細胞培養(yǎng)液中, 研究它們對成骨細胞增殖與分化成熟的影響；細胞增殖采用MTT法進行分析; 細胞分化并于培養(yǎng)第5天檢測堿性磷酸酶活性(組織化學(xué)法)。結(jié)果：①P0 代細胞接種培養(yǎng)至12 h 左右貼壁,24 h 后數(shù)量明顯增加,體積開始增大, 3d 后細胞開始交聯(lián)融合;②細胞培養(yǎng)1d、2d、3d檢測，實驗組與對照組成骨細胞增值率差異顯著（P<0.05），組間比較金剛健骨片組較福善美組、骨松寶組差異明顯（P<0.05）；③電鏡下觀察成骨細胞堿性磷酸酶染色陽性率，可見實驗組較對照組明顯；組間比較，金剛健骨片組陽性率最為顯著。結(jié)論：補腎填精中藥及西藥對照組含藥血清均可促進成骨細胞的增殖、分化，提高成骨細胞的活性，金剛健骨片作用最為明顯。

關(guān)鍵詞：補腎填精；細胞培養(yǎng)；成骨細胞；堿性磷酸酶；增殖；分化

Abstract:: Objective: To investigate the effect of osteoporosis on proliferation and differentiation of osteoblasts and alkaline phosphatase expression, to provide experimental evidence for treating osteoporosis drugs for nourishing kidney-essence.Methods: the serum pharmacology of traditional Chinese medicine preparation method of Tonifying the kidney essence of medicated serum of rats with multiple enzyme digestion; osteoblasts in vitro; the kidney in different experimental groups were added to fill the refined pastille serum of newborn rats osteoblasts in culture medium, to study their effects on osteoblast proliferation and differentiation; cell proliferation was determined by MTT analysis; cell differentiation and cultured for fifth days in the alkaline phosphatase activity test (histochemical method).Results: P0 cells were cultured for 12 h or 24 h after adherent, significantly increased the number, volume began to increase after 3D, cells begin to cross fusion; 1D, 2D, 3D detection of cell culture, differences between the experimental group and the control of osteoblast growth rate significantly (P<0.05), comparisons between groups Jingang Jiangu slice group than Fosamax group, Gusongbao group significantly (P<0.05); ③ electron microscope into bone cells alkaline phosphatase staining positive rate, showed the experimental group than in the control group significantly; comparison between groups, osteoporosis group positive rate is the most significant.Conclusion: Bushen Chinese medicine and Western medicine control group containing serum can stimulate the proliferation, differentiation of bone cells, improve the activity of osteoblasts, Jingang Jiangu tablet for the most obvious role.

Keywords: Bushen Tianjing; cell culture; osteoblast; alkaline phosphatase; proliferation; differentiation

【中圖分類號】R969 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-8602(2014)05-0009-02

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增高而骨折危險性增加的一種全身性骨骼疾病[1]。近20 年來， 國內(nèi)廣泛開展了中醫(yī)中藥及中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松癥的研究， 中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的療效已經(jīng)得到一定范圍的學(xué)術(shù)認同，并引起較廣泛重視[2]。中醫(yī)學(xué)認為"腎虛髓虧"是骨質(zhì)疏松發(fā)病的核心中醫(yī)病理本質(zhì)[3]。補腎填精法是中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的核心治法之一。金剛健骨片作為補腎填精法的代表方，在臨床中應(yīng)用較廣，前期研究已證實其較好的臨床作用及其對骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因的正向作用[4]。本實驗擬通過應(yīng)用不同組別的補腎填精含藥血清對體外培養(yǎng)的成骨細胞進行干預(yù)，觀察其對成骨細胞增殖、分化的影響，探討補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物:

新生24h內(nèi)SD大鼠5只，SPF級，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，用于成骨細胞的體外分離及培養(yǎng)；成年SD大鼠（300g±20g）40只，雌雄各半，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，用于制備含藥血清。

1.2 主要儀器、試劑:

①胎牛血清（FBS）（GIBCO，美國）；②MEM培養(yǎng)基（GIBCO，美國）；③I型膠原蛋白酶（Sigma，美國）；④0.25%胰蛋白酶（GIBCO，美國）；⑤茜素紅S（Sigma，美國）；⑥Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)（同仁化學(xué)，日本）；⑦實驗室常用化學(xué)試劑（國藥集團，中國）；⑧DEPC（Sigma，美國）；⑨StepOnePlusTM RT-PCR系統(tǒng)（ABI公司，美國）；⑩PCR儀（Bio-Rad，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒（TaKaRa，日本）。

1.3 藥物及含藥血清制備:

①福善美，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，用量：70mg/片，每周一片，生產(chǎn)批號：120511；②金剛健骨片，由補骨脂、熟地黃、川牛膝、鹿角膠、菟絲子、肉蓯蓉、杜仲、粉萆、山藥組成，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，用量：0.3g/片，一次10片，一日3次，生產(chǎn)批號：20120924；③骨松寶，由淫羊藿、赤芍、三棱、莪術(shù)等組成，貴州富華藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，用量，0.5g/粒，一次2粒，一日3次，生產(chǎn)批號：20120503；④生理鹽水購自國藥集團。

以上藥物按照人與大鼠劑量換算公式折算為大鼠每天的等效劑量，連續(xù)灌胃2次，間隔2次，于末次給藥1h后，以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后經(jīng)腹主動脈采取全血，室溫靜置2小時后以1500rpm離心20min，吸出上層血清，一次性濾器抽濾除菌，56℃滅活30min后分裝待用，保存于-80℃冰箱。

1.4 成骨細胞的體外提取及培養(yǎng):

取新生24h內(nèi)SD大鼠5只，浸沒于75%酒精10min，脫頸處死后在無菌條件下分離大鼠顱蓋骨；PBS反復(fù)清洗以清除骨片表面附著的血管、粘膜等結(jié)締組織；以眼科剪將骨組織剪碎，碎片約1mm3；以5ml 0.25%胰蛋白酶將骨片消化20min；棄胰蛋白酶消化液，加入5ml 0.1%I型膠原蛋白酶37℃恒溫氣浴震蕩消化45min，收集上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管，1000r/min離心5min；將剩余骨片在0.1%I型膠原蛋白酶中重復(fù)消化2次，1000r/min離心5min；將三次所得細胞以MEM培養(yǎng)液（含15%FBS）反復(fù)吹打混勻，制成細胞懸液，以105/ml的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；每天于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，隔天換液一次。當(dāng)細胞生長至匯合時，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1:3傳代培養(yǎng)，第三代細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 實驗分組及干預(yù)方案:

本研究共分四組：①福善美組（10%福善美含藥血清+MEM培養(yǎng)基+雙抗）②金剛健骨片組（10%金剛健骨片含藥血清+MEM培養(yǎng)基+雙抗）③骨松寶組（10%骨松寶含藥血清+MEM培養(yǎng)基+雙抗）④對照組（10%生理鹽水含藥血清+MEM培養(yǎng)基+雙抗）

1.6 成骨細胞增值率的檢測:

取第三代成骨細胞，以每孔5000個細胞的密度接種于96孔板，每組各設(shè)置6個復(fù)孔，24h后棄上清，加入含各組相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液，分別于加藥干預(yù)培養(yǎng)1d、2d及3d時取出孔板，棄培養(yǎng)液，各孔加入10% CCK-8試劑，37℃孵育2h，于450nm處測定各孔的吸光度值。

1.7 成骨細胞堿性磷酸酶染色:

第三代細胞以105/ml的密度接種于六孔板，細胞貼壁后更換為含各組藥物的培養(yǎng)液干預(yù)培養(yǎng)5d，隔天換液一次，收取培養(yǎng)板時，棄培養(yǎng)液，以中性福爾馬林固定細胞5min，PBS清洗兩次，將NBT/BCIP染色液覆蓋細胞表面，避光染色1h，PBS清洗兩次后置于光鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法: 所有實驗采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）形式表示，P<0.05則認為數(shù)據(jù)間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；各組組間比較采用One-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 成骨細胞形態(tài)學(xué)觀察:

圖1光鏡下的成骨細胞（×100）

圖1注：A：原代成骨細胞培養(yǎng)24h（×100）；B：原代成骨細胞培養(yǎng)3d（×100）

圖1可見： P0 代細胞接種培養(yǎng)至8 ～12 h 左右貼壁， 形態(tài)呈三角形、紡錘形或多角形等( 圖1A)， 24 h 后數(shù)量明顯增加， 體積開始增大， 3d 后細胞開始交聯(lián)融合 ( 圖1B)。 圖片顯示補腎填精中藥及西藥對照組含藥血清均可可明顯促進成骨細胞的分化。

2.2 成骨細胞增殖檢測:

表1 成骨細胞增殖率檢測

組別 N 1d 2d 3d

福善美組 6 1.249±0.024①② 1.803±0.045① 2.308±0.054①

金剛健骨片組 6 1.185±0.009①②③ 1.931±0.056①②③ 2.607±0.061①②③

骨松寶組 6 1.126±0.032① 1.778±0.048① 2.343±0.095①

對照組 6 1.065±0.019 1.504±0.044 1.992±0.024

注：①與對照組比較，P<0.05；②與骨松寶組比較，P<0.05；③與福善美組比較，P<0.05；

表1顯示：培養(yǎng)1d檢測，實驗諸組與對照組細胞增殖率有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），以西藥對照組福善美組最為明顯；細胞培養(yǎng)2d、3d檢測，實驗組與對照組差異較前顯著（P<0.05），組間比較金剛健骨片組成骨細胞增值率較福善美組、骨松寶組差異明顯（P<0.05）。結(jié)果表明：補腎填精及西藥含藥血清對成骨細胞的增殖均有明顯促進作用，初期以福善美組明顯，隨培養(yǎng)時間推移，金剛健骨片組對成骨細胞的促進作用增強，其正向作用強于西藥對照組。

2.3 成骨細胞堿性磷酸酶染色：

圖2 成骨細胞堿性磷酸酶染色

圖2注：A：福善美組；B：金剛健骨片組；C：骨松寶組；D：對照組

圖2可見：含藥培養(yǎng)液干預(yù)培養(yǎng)5d后電鏡下觀察染色陽性率，可見A組福善美組、B組金剛健骨片組及C組骨松寶組其成骨細胞的活性較對照組D組明顯；實驗組間比較， B組金剛健骨片組陽性率最為明顯，福善美組次之，骨松寶組較差。圖2表明：實驗各組（A/B/C）均可提高成骨細胞的活性，金剛健骨片組效果最強。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥屬于祖國醫(yī)學(xué)"骨痿"范疇。 "腎虛髓虧"是骨質(zhì)疏松發(fā)病的核心中醫(yī)病理本質(zhì)，補腎填精法是中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的重要治法。金剛健骨片在古方"金剛丸"的基礎(chǔ)上化裁而成，是補腎填精中藥的代表方之一，全方由補骨脂、熟地黃、川牛膝、鹿角膠、菟絲子、肉蓯蓉、杜仲、粉萆、山藥組成，其中以熟地黃、鹿角膠為君藥補腎生髓；補骨脂、肉蓯蓉、杜仲、菟絲子為臣，補腎益精，強筋健骨；配以川牛膝、粉萆、山藥祛風(fēng)除痹、引藥下行。具有補腎益髓，健骨強筋的功效。前期的臨床研究證明其對于老年或婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有著較好的臨療效[4]，但其作用機制及途徑尚待探討。

成骨細胞是骨形成的主要功能單位， 刺激成骨細胞增殖并促進其分化成熟是防治骨質(zhì)疏松癥的主要方法。體外培養(yǎng)成骨細胞是藥效評價和新藥開發(fā)的重要研究手段[5]。體外培養(yǎng)和實驗用的成骨細胞均經(jīng)過細胞增殖、細胞外基質(zhì)成熟和基質(zhì)礦化3個階段[6]， 與體內(nèi)發(fā)育有相似之處， 其在骨重建過程中發(fā)揮重要作用，用離體成骨細胞培養(yǎng)可觀察到藥物的直接作用，可作為抗骨質(zhì)疏松藥物篩選的重要途徑。本實驗研究發(fā)現(xiàn)：通過不同時段成骨細胞形態(tài)學(xué)的觀察以及成骨細胞增值率的檢測，補腎填精中藥及西藥對照組均可對對成骨細胞增殖率有明顯影響，可促成骨細胞的分化的作用，從而促進骨形成，其中金剛健骨片的作用強于中藥與西藥對照組；其成骨細胞增值率的檢測變化與培養(yǎng)時間有一定的相關(guān)性，早期以西藥對照組作用明顯，其后隨培養(yǎng)時間推移，金剛健骨片作用更為明顯。

ALP活性是成骨細胞功能及分化程度的重要指標(biāo)， 其活性的高低可反映成骨細胞的成熟狀態(tài)，ALP活性越高，表明細胞越趨成熟，而ALP活性降低，則說明細胞趨于增殖狀態(tài)[7]

。 因此， 測定細胞內(nèi)ALP活性，能反映某一影響因素的效應(yīng)。本研究證實：補腎填精中藥及西藥對照組對成骨細胞的代謝均有一定的效應(yīng)，電鏡下大體觀察，金剛健骨片組對成骨細胞堿性磷酸酶染色的陽性率最為明顯。

本研究通過補腎填精

含藥血清對體外培養(yǎng)的成骨細胞進行干預(yù)， 觀察對其增殖和分化的影響， 從而探討補腎填精藥物促進成骨細胞增殖、分化及其防治骨質(zhì)疏松的可能機制。實驗表明：以金剛健骨片為代表的補腎填精中藥含藥血清能促進成骨細胞的增殖、提高細胞內(nèi)ALP活性，這可能是其防治骨質(zhì)疏松的細胞學(xué)機制之一，為補腎填精法治療骨質(zhì)疏松癥的進一步研究提供實驗依據(jù)。

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