田海嬌　吳昊　楊洪巖

摘要 纖維素酶能夠?qū)⒗w維素分解為葡萄糖。該酶在解決當(dāng)前世界面臨的能源、糧食、環(huán)境污染等危機(jī)方面具有重要意義。然而，迄今為止纖維素酶活和產(chǎn)率均較低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高，都嚴(yán)重地阻礙其工業(yè)化的應(yīng)用。因此，如何提高纖維素產(chǎn)生菌產(chǎn)酶能力是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，從培養(yǎng)體系的優(yōu)化（碳源、氮源、表面活性劑和未知生長(zhǎng)因子）、培養(yǎng)條件的優(yōu)化（溫度、pH、溶氧量）、菌種改造（化學(xué)誘變、物理誘變、物理化學(xué)復(fù)合誘變、基因工程法）等方面對(duì)優(yōu)化菌種產(chǎn)酶能力的方法進(jìn)行了分析與總結(jié)。目前，雖在培養(yǎng)條件優(yōu)化和菌種分子改造方面初有成效，但還沒(méi)有一種方法能夠大幅提升酶活性。今后，應(yīng)加強(qiáng)菌種選育和發(fā)酵工藝等基礎(chǔ)研究工作，分離和篩選出高效纖維素分解菌群，并用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步優(yōu)化菌種，提高酶活。

關(guān)鍵詞 纖維素酶；微生物；培養(yǎng)體系；培養(yǎng)條件；菌種改造

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）05-01281-06

Abstract Cellulases can hydrolyze cellulose to glucose. It is important to solve the problem of energy shortage， food crisis and environmental pollution in the world. However， enzyme activity and production efficiency have been very low till now. Due to long production period and high cost， industrial application of cellulase is severely hampered. Therefore， how to improve the capacity of enzyme production has become a focus involved in cellulase production in recent years. In this study， advances in methods to improve cellulases were summarized. Optimization of culture system （carbon， nitrogen， surfactants and unknown growth factors）， optimization of culture conditions （temperature， pH and dissolved oxygen） and construction of microorganism （chemical mutation， physical mutation， combined physical and chemical mutagenesis and genetic engineering） were involved. Based on the current researches， no methods can effectively enhance the enzyme activity， although some progresses have been achieved in optimization of culture conditions and molecular transformation for strains. In the future， research on microbial selection and fermentation technique should be strengthened. Molecular biological method should be applied for further exploring the improvement of enzyme activity.

Key words Cellulase； Microorganism； Culture system； Cultivation conditions； Strain modification

隨著人口的增長(zhǎng)、生活水平的提高和工業(yè)化進(jìn)程的加速，全球的能源需求逐漸增加，由此產(chǎn)生的能源安全、石油消耗、全球變暖等問(wèn)題促使世界各國(guó)加快了對(duì)替代能源的研究。纖維素乙醇的研究與開(kāi)發(fā)已成為世界各國(guó)研發(fā)的熱點(diǎn)。纖維素（Cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機(jī)溶劑，是植物細(xì)胞壁的主要成分，是地球上最古老、最豐富的天然高分子，是取之不盡、用之不竭的人類最寶貴的天然可再生資源。欲利用纖維素，首先需要將纖維素進(jìn)行降解。纖維素的降解包括物理法、化學(xué)法和生物法。生物降解以其條件溫和、耗能低和污染少等特點(diǎn)，成為目前新能源研究的方向之一。

纖維素的生物降解主要通過(guò)纖維素酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。纖維素酶是使纖維素分解生成葡萄糖的一組酶的總稱，在輕工業(yè)如造紙、食品、飼料、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用正日益廣泛，潛力巨大。其最大的潛在用途是將纖維類物質(zhì)酶法水解成葡萄糖，進(jìn)一步發(fā)酵生成酒精等能源物質(zhì)，造福人類。然而，迄今為止纖維素酶活和產(chǎn)率均較低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高。這些都嚴(yán)重阻礙其工業(yè)化的應(yīng)用[1]。

自然界中微生物是纖維素酶的主要貢獻(xiàn)者?？梢苑置诶w維素酶的菌種包括細(xì)菌、放線菌和真菌，其中絲狀真菌是研究最多的纖維素降解類群?？v觀國(guó)內(nèi)外的研究，發(fā)現(xiàn)纖維素高效分解菌的選育仍然是纖維素酶研究的重點(diǎn)之一。同時(shí)，利用合適的方法提高篩選的微生物菌株的產(chǎn)酶能力、穩(wěn)定產(chǎn)酶特性是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。相關(guān)的研究也將對(duì)解決目前能源危機(jī)、糧食短缺以及環(huán)境污染等一系列問(wèn)題具有重要的意義[2]。該研究綜合目前國(guó)內(nèi)外的研究成果，對(duì)提高纖維素酶活的方法進(jìn)行總結(jié)，并且根據(jù)現(xiàn)狀提出進(jìn)一步提高酶活方法的建議，以期為纖維素酶的生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 培養(yǎng)體系的優(yōu)化

1.1 碳源

纖維素酶是誘導(dǎo)酶。理想的碳源應(yīng)該既能提供菌種生長(zhǎng)所需能量，又能誘導(dǎo)纖維素酶基因的高效表達(dá)[3]。據(jù)報(bào)道，碳源對(duì)菌絲細(xì)胞合成纖維素酶的影響很大[4]。一般認(rèn)為，碳源的性質(zhì)和類型是決定酶產(chǎn)生成敗的關(guān)鍵之一。培養(yǎng)基的碳源一般為碳水化合物。碳源在酶制劑生產(chǎn)中的作用較復(fù)雜。除了供給微生物所需的能源外，它往往對(duì)產(chǎn)酶有誘導(dǎo)與阻遏作用。

碳源的種類有很多，研究主要側(cè)重能夠促使產(chǎn)酶量增加的纖維素類和糖類。季更生等[5]對(duì)綠色木霉的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以5.0 g/L硫酸鹽紙漿為碳源，纖維素酶活值為27.96 IU/ml，其值是以纖維素為碳源時(shí)的2.19倍。Dashtban等[6]研究3種不同類型的Trichoderma reesei，分別為QM6a（野生型）、QM9414（突變體）和RUTC30，發(fā)現(xiàn)以微晶纖維素為碳源時(shí)均有較高的酶活性，并且突變體和RUTC30顯著大于野生型。Aftab 等[7]發(fā)現(xiàn)，利用更高濃度纖維素（50 g/L）和乳糖（150 g/L）的培養(yǎng)基可獲得更高的產(chǎn)酶量。Matkar等[8]分離出一株Aspergillus niger，也發(fā)現(xiàn)在菌種產(chǎn)酶補(bǔ)給碳源時(shí)，乳糖對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)有誘導(dǎo)作用。還有一些其他碳源也被發(fā)現(xiàn)，例如Deswal等[9]新分離出一株褐腐菌，研究其產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。在不同的碳源試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)以麥麩為碳源時(shí)產(chǎn)酶的酶活性最大。一些經(jīng)預(yù)處理得到的碳源被證明更能激發(fā)菌種的產(chǎn)酶能力。Parka等[10]將milk pack（MP）與纖維素酶（3 FillterPaper Unit（FPA）/g MP）混合處理作為Acremonium cellulolyticus菌種的唯一碳源時(shí)，在3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，所得纖維素酶的活性為16 FPA/ml，相比未處理的純纖維素高出25倍。

目前，產(chǎn)纖維素酶的菌種培養(yǎng)基中的碳源主要有纖維素、乳糖、蔗糖、羧甲基纖維素（CMC）、葡萄糖。其中，以纖維素、乳糖為碳源時(shí)更能誘導(dǎo)菌種產(chǎn)酶。筆者研究Trichoderma sp.菌種產(chǎn)酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加乳糖可以顯著增加培養(yǎng)體系的濾紙酶活，體系內(nèi)添加10 g/L乳糖可以使濾紙酶活由原始的最高值0.16 IU上升到0.56 IU。葡萄糖主要是提供菌種生長(zhǎng)所需能量，對(duì)產(chǎn)酶促進(jìn)作用不大，用同位素14C、3H標(biāo)記發(fā)現(xiàn)葡萄糖是抑制纖維素酶的合成，而不是抑制酶的分泌[11]。

1.2 氮源

在培養(yǎng)基中添加合適的營(yíng)養(yǎng)成分能夠顯著提高纖維素酶活性，比如適宜的氮源能較好地促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，調(diào)控和改善其產(chǎn)酶能力。氮源的種類有很多。不同的菌種適宜的氮源有很大的差異。

目前，在一些研究中發(fā)現(xiàn)酵母提取物能夠促進(jìn)產(chǎn)酶。Aftab等[7]在利用絲狀真菌（T.reesei）產(chǎn)纖維素酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用纖維素——酵母提取物的培養(yǎng)基能達(dá)到最大酶活性和細(xì)胞生長(zhǎng)量，F(xiàn)PA達(dá)到5.02 U/ml，CMC酶活為4.2 U/ml，并且真菌生物量達(dá)14.7 g/L。由此可知，以酵母提取物為氮源能促進(jìn)酶的產(chǎn)量、活性。類似的發(fā)現(xiàn)還有Domingues等[12]在研究T.reesei RUTC30產(chǎn)纖維素酶時(shí)也發(fā)現(xiàn)酵母提取物能促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶量。筆者等研究發(fā)現(xiàn)在Trichoderma sp.菌種產(chǎn)酶的培養(yǎng)體系中加入15 g/L酵母提取物，可以使得體系2 d的濾紙酶活由0.60 IU提高到0.92 IU。

蛋白胨作為比較普遍的氮源也被肯定了其價(jià)值。勇強(qiáng)等[13]在研究里氏木霉木聚糖酶和纖維素酶的生物合成時(shí)發(fā)現(xiàn)在各種氮源中，蛋白胨是最好的氮源，并且在復(fù)合氮源中當(dāng)硫酸銨和尿素的比例為1∶3時(shí)，木聚糖酶活力最高，達(dá)93.3 IU/ml；當(dāng)比例為1∶1時(shí)，F(xiàn)PA和CMC酶活力達(dá)到最大值，分別為0.263和0.026 IU/ml。由此可知，調(diào)整不同的氮源比例顯示不同纖維素酶活力。

一些銨鹽、尿素也被用作氮源，并顯示出其對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用。邱雁臨[14]發(fā)現(xiàn)，在綠色木霉的纖維素酶酶活培養(yǎng)基中添加氮源（NH4）2SO4 為0.5%時(shí)，纖維素酶活性達(dá)到較高水平。Deswal等[9]在對(duì)產(chǎn)纖維素酶的褐腐菌的培養(yǎng)基條件的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)以尿素為氮源時(shí)可以達(dá)到最大產(chǎn)酶量。Vu等[15]經(jīng)鈷60γ射線、紫外線照射，與N甲基N硝基N亞硝基胍誘變處理后得一突變菌——曲霉菌。在研究其固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加氯化銨、尿素、麥芽提取物等氮源能夠顯著提高纖維素酶產(chǎn)量。

目前的研究表明，培養(yǎng)不同菌株的適宜氮源不同。主要的氮源有蛋白胨、酵母提取物、銨鹽、尿素等，且有機(jī)氮優(yōu)于無(wú)機(jī)氮，銨態(tài)氮優(yōu)于硝態(tài)氮，無(wú)機(jī)氮中以硫酸銨最佳，有機(jī)氮中蛋白胨促進(jìn)產(chǎn)酶的效果最好，并能夠保持菌種良好生長(zhǎng)，且被認(rèn)為是最佳氮源。大量研究也表明，酵母提取物能夠顯著促進(jìn)菌種產(chǎn)酶，其他氮源也有一定的促進(jìn)作用。但是，關(guān)于它起作用的程度、機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

1.3 表面活性劑和未知生長(zhǎng)因子

研究表明，一些表面活性劑可以提高菌種的產(chǎn)酶能力。有研究表明，纖維素酶的分泌與細(xì)胞膜的通透性有著密切的關(guān)系[16]。在綠色木霉QM86培養(yǎng)基中添加一定濃度的油酸鈉、亞油酸鈉、Tween 80和蔗糖單棕櫚酯等表面活性劑，結(jié)果表明它們都大量增加纖維素酶產(chǎn)量，且縮短產(chǎn)酶時(shí)間。Domingues等[12]研究發(fā)現(xiàn)，使用Tween 80能抑制發(fā)酵過(guò)程中菌絲體形成球狀，促進(jìn)酶的分泌。有研究表明，在纖維素酶解體系中添加適量的Tween 20，能夠顯著提高纖維素酶的酶解效果[17]。Soni等[18]研究一個(gè)多功能的煙曲霉，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的Tween 80（0.24%）能夠促進(jìn)纖維素酶的產(chǎn)生。這可能是由于表面活性劑的非離子型的刺激作用改變了細(xì)胞膜的通透性。Vu等[15]在研究誘變菌株的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)體系中添加吐溫80和EDTA能夠有效地促進(jìn)纖維素酶的生產(chǎn)。筆者研究發(fā)現(xiàn)，添加Tween 80對(duì)Trichoderma sp.培養(yǎng)體系4 d的酶活有微弱的促進(jìn)作用。當(dāng)Tween 80與酵母提取物聯(lián)合添加時(shí)對(duì)酶活的增加效果與單獨(dú)增加酵母提取物的處理沒(méi)有顯著的區(qū)別。

還有一些離子也起到促進(jìn)的作用。蒲海燕[19]發(fā)現(xiàn)，鈣離子是纖維素酶的重要穩(wěn)定劑，添加含鈣離子的溶液對(duì)酶的產(chǎn)生有顯著的促進(jìn)效果，NaH2PO4對(duì)產(chǎn)酶也有一定的促進(jìn)作用。有些未知的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)產(chǎn)酶也有效果。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，玉米芯有利于β葡萄糖苷酶的生產(chǎn)[20]，同時(shí)玉米芯中某些成分對(duì)木聚糖酶也有一定的促進(jìn)作用[21]。這可能與玉米芯除了具有一定的誘導(dǎo)作用外還含有相對(duì)較多的可以供菌體生長(zhǎng)所利用的營(yíng)養(yǎng)成分和未知因子有關(guān)。

表面活性劑和一些未知生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)菌種產(chǎn)酶?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究較多的為Tween 80的促進(jìn)作用，其他因子作用很少見(jiàn)報(bào)道，由于機(jī)理尚不清楚，所以具有一定偶然性。當(dāng)確定應(yīng)用表面活性劑和一些未知生長(zhǎng)因子時(shí)，由于菌種、培養(yǎng)條件有所不同，在應(yīng)用劑量上需要調(diào)試。這些均需要進(jìn)一步的探索及總結(jié)。

2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1 溫度

在發(fā)酵物的培養(yǎng)條件中，溫度對(duì)菌種的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶量的影響很大。研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)溫度下，菌體生長(zhǎng)速度、孢子數(shù)量、菌落顏色、酶活力高峰期的出現(xiàn)時(shí)間均有不同。徐昶等[22]對(duì)灰綠曲霉的研究中發(fā)現(xiàn)，灰綠曲霉XC9 在較低溫度（25 ℃）下培養(yǎng)，菌體生長(zhǎng)緩慢，孢子數(shù)量少，呈淺綠色，酶活力高峰期出現(xiàn)晚。在溫度較高（35 ℃）時(shí)培養(yǎng)，菌體生長(zhǎng)旺盛，孢子多，呈綠色，酶活高峰期出現(xiàn)早，但酶量偏低，表明該菌株產(chǎn)酶較適宜的溫度為30 ℃ 。董志揚(yáng)等[23]采用物理化學(xué)誘變的方法誘變出一株產(chǎn)酶能力較高的菌株T801，發(fā)現(xiàn)最適培養(yǎng)溫度為28～30 ℃。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)一些菌種產(chǎn)酶的適宜溫度較高，比如Liu等[24]發(fā)現(xiàn)一株耐高溫的產(chǎn)纖維素酶的煙曲霉，在固態(tài)發(fā)酵下最優(yōu)產(chǎn)酶溫度為50 ℃。Shu等[25]在研究T.reesei產(chǎn)纖維素酶的影響因子中，菌種的最佳產(chǎn)酶溫度為30 ℃。Gautam等[26]在優(yōu)化菌種產(chǎn)酶條件的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)黑曲霉與木霉的產(chǎn)酶能力要高于其他真菌，并且其最適產(chǎn)酶溫度分別為40和45 ℃。Sohail等[27]在研究曲霉MS82產(chǎn)纖維素酶時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)溫度在35 ℃時(shí)，酶產(chǎn)量最高。Chandra等[28]利用木霉以青蒿渣為底物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，測(cè)得FP酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶的3種酶產(chǎn)量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度為28 ℃。 Chu等[29]研究由griseoaurantiacus ZQBC691降解竹葉中的纖維素產(chǎn)酶，發(fā)現(xiàn)其最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，此時(shí)的CMC濃度為15 g/L，還原糖的最終濃度達(dá)到1.60 g/L。

已有的研究表明，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，酶量偏低。當(dāng)溫度較低時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶效率低；當(dāng)溫度處于中間適宜時(shí)，菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶量達(dá)到一個(gè)理想的平衡狀態(tài)。一般，多數(shù)菌體產(chǎn)纖維素酶的適宜溫度為28～35 ℃。也有一些耐熱菌的最適產(chǎn)酶溫度較高，可達(dá)到40～50 ℃。

2.2 pH

在菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件中，適宜的pH對(duì)其菌體的自身生長(zhǎng)、產(chǎn)酶量也起著重要的作用。它是一個(gè)重要的衡量指標(biāo)。曾露[30]等從堆肥化處理的甘蔗葉中分離出一株纖維素酶產(chǎn)生菌，通過(guò)調(diào)整發(fā)酵過(guò)程中pH的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為8時(shí)，酶活性相對(duì)較高。甄靜等[31]從枯枝敗葉的土壤中分離出一株耐高溫、堿性纖維素酶的真菌，并通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，調(diào)整pH，最后鎖定該菌產(chǎn)酶的最適pH為7.5。錢林[32]從黃浦江淀山湖的水底沉積物中篩選、分離得到一株產(chǎn)纖維素酶的菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株在pH 7.0 的條件下，發(fā)酵66 h 后纖維素酶活達(dá)到最高值。Gautam等[26]在優(yōu)化菌種產(chǎn)酶條件的試驗(yàn)中，為選出最適pH，使黑曲霉與木霉在含有50 ml的優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)置pH范圍為3.0～9.0，發(fā)現(xiàn)兩者的最適pH分別為6.7和6.5。也有的產(chǎn)纖維素酶的菌種經(jīng)誘變處理后，其最適產(chǎn)酶pH偏酸性，比如Liu等[33]將產(chǎn)纖維素酶菌株經(jīng)過(guò)甲磺酸乙酯（EMS）和紫外線照射處理獲得突變體，改突變體的最適產(chǎn)酶pH是5.7。

研究表明，在菌體產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件中，過(guò)酸和過(guò)堿環(huán)境都不利于菌種產(chǎn)酶，一般中性環(huán)境下菌體產(chǎn)酶量較理想，也有一些誘變處理后的菌體最適產(chǎn)酶pH與原始出發(fā)菌株相比會(huì)發(fā)生變化。這需要在實(shí)際工作中進(jìn)一步摸索。

2.3 溶氧量

產(chǎn)纖維素酶的菌種中有很多是屬于好養(yǎng)菌。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中適當(dāng)?shù)娜苎趿考饶鼙ＷC菌體的優(yōu)良生長(zhǎng)，又能促使菌體產(chǎn)酶。氧氣不足，致使菌體生長(zhǎng)受限；氧氣過(guò)高，致使培養(yǎng)體系蒸發(fā)失水，微生物代謝受限。因此，調(diào)控好發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的溶氧量對(duì)優(yōu)化培養(yǎng)條件尤為重要。

實(shí)驗(yàn)室中多采用搖瓶培養(yǎng)的方法，此時(shí)的溶氧量由搖床轉(zhuǎn)速和搖瓶裝液量來(lái)實(shí)現(xiàn)。劉靖[34]在優(yōu)化斜臥青霉的產(chǎn)酶條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)載量和轉(zhuǎn)速過(guò)高或過(guò)低，都不利于菌種生長(zhǎng)、產(chǎn)酶。一般，在500 ml搖瓶中加入100 ml培養(yǎng)基，200 r/min時(shí)，其菌種產(chǎn)酶活力最高。搖瓶培養(yǎng)為菌種從實(shí)驗(yàn)室走向生產(chǎn)的必經(jīng)階段。由于搖瓶培養(yǎng)屬于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)性質(zhì)的培養(yǎng)，菌種應(yīng)用于生產(chǎn)前具體培養(yǎng)條件、產(chǎn)酶條件的摸索需要通過(guò)反應(yīng)器來(lái)實(shí)現(xiàn)。相關(guān)研究表明，在攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的菌種細(xì)胞生長(zhǎng)量和纖維素酶產(chǎn)量相比于在搖床振蕩培養(yǎng)中高出2倍[35]。

從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)到發(fā)酵生產(chǎn)中，影響溶氧量的因素也發(fā)生變化，一般在生產(chǎn)中溶氧量的改變通常通過(guò)改變轉(zhuǎn)速和通氣量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)通氣量改變?nèi)苎趿康姆椒ū容^常見(jiàn)。Zhi等[36]研究了溶氧量對(duì)里氏木霉的影響，發(fā)現(xiàn)在通氣量從0.4提到0.5 VVM過(guò)程中，菌絲體的質(zhì)量濃度也在增加，從2.77 g /L到2.98 g /L，相應(yīng)產(chǎn)生的濾紙酶活從2.79 IU/ml到2.98 IU/ml，由此看出在一定范圍內(nèi)，溶氧量增加可以小幅度促使菌種產(chǎn)酶。Shahriarinour等[35]研究了在恒定攪拌速度下，不同溶氧量對(duì)由Aspergillus菌種產(chǎn)生的胞外纖維素酶（FPA、CMC酶、β葡萄糖苷酶）產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)空氣飽和度為55%時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)量和纖維素酶產(chǎn)量最大，在40%和80%時(shí)都較小，而且在55%時(shí)，F(xiàn)PA、CMC酶和β葡萄糖苷酶的活性均最高，分別為2.33、51.10、16.18 U/ml。由此可知，通氣量過(guò)高和過(guò)低都不利于菌種生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，通氣量適中較合適。研究還發(fā)現(xiàn)，適合菌種生長(zhǎng)和適合菌種產(chǎn)酶的溶氧量可能有所不同。Cao等[37]研究了由BH14 Cellulophaga lytica生產(chǎn)CMC酶，在7 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)微生物、攪拌速度和通氣量共同影響纖維素酶的產(chǎn)量，利用響應(yīng)面法優(yōu)化生長(zhǎng)和產(chǎn)酶條件，發(fā)現(xiàn)適合細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳攪拌速度為395 r/min，通氣量為0.98 VVM，而在生產(chǎn)CMC酶的反應(yīng)體系中最佳攪拌速度為357 r/min，通氣量為0.55 VVM。

從搖瓶到反應(yīng)器即從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)上的過(guò)渡過(guò)程中，溶氧量對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響至關(guān)重要。在優(yōu)化菌種產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件下，溶氧量即是保證菌種正常生長(zhǎng)所需的必要條件，也是控制菌種產(chǎn)酶的重要因素。大量試驗(yàn)表明，溶氧量要控制在一定范圍內(nèi)才能有效地促進(jìn)菌種生長(zhǎng)、產(chǎn)酶。

3 菌種改造

菌種改造是指在人為的條件下，采取物理、化學(xué)、生物基因工程等技術(shù)手段致使菌體本身的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這種改變是隨機(jī)的、不定向的，采取誘變方法獲得新菌種，探究其生長(zhǎng)、應(yīng)用能力。其目的是誘發(fā)基因突變，選育出有利于投入生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。其意義在于誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變后，可從中選擇、培育微生物的新品種。新品種可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)于采用不同方法對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌種進(jìn)行誘變的研究很多，但是何種誘變方法對(duì)纖維素菌種選育最有效，不同誘變方法獲得的菌種是否具有相同的性能，都存在很大的爭(zhēng)議。

3.1 物理誘變

誘變選育中應(yīng)用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發(fā)變異。但是，關(guān)于產(chǎn)酶菌種的誘變還是以紫外誘變居多，并且達(dá)到理想的效果。

方尚玲等[38]對(duì)分離篩選出的1株產(chǎn)纖維素酶活力較高的木霉（CMC 酶活609.5 U/g 干曲、FPA酶活133.8 U/g干曲）進(jìn)行紫外線及原生質(zhì)體紫外線復(fù)合誘變，得到產(chǎn)酶活力很高的菌株，其CMC 酶活達(dá)到1 332.9 U/g干曲，F(xiàn)PA酶活達(dá)到301.6 U/g干曲，分別為原始菌株的2.19、2.25倍。Liu等[39]從土壤中分離一株菌株，紫外誘變產(chǎn)纖維素酶菌株，發(fā)現(xiàn)暴露于紫外線4 min的條件下酶活達(dá)到最高[（107.75 μg/（ml·min）]。韓銘海等[40]通過(guò)紫外線和γ射線交替誘變，篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株BE40239，與出發(fā)株相比，其產(chǎn)酶能力提高1.3倍，發(fā)酵性狀與出發(fā)菌株也有明顯的差異。孫君社等[41]以康氏木霉TR為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外線誘變，結(jié)合雙層平板分離技術(shù)選育出1株纖維素酶活力明顯提高的菌株TR6，并通過(guò)對(duì)康氏木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基、接種量、氮源、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件的研究，通過(guò)測(cè)定其所產(chǎn)CMC酶活和FPA，找到最佳的產(chǎn)酶條件，即秸稈粉∶麩皮為 1∶1，固液比為 1∶3，添加硫酸銨為氮源，添加量為2%，接種量5%，30 ℃培養(yǎng)84 h 左右為宜，CMC酶活、FPA分別達(dá)到468.27和275.31 U/g。

物理誘變的方法較簡(jiǎn)便、快捷，能迅速誘變菌體，但其誘變有不明確性，突變較隨機(jī)，需要重復(fù)性大量試驗(yàn)才能確定適宜的誘變條件，獲得產(chǎn)酶活性較高的誘變育種。由于目前該方法仍是一種快捷的方法，被廣泛使用。最普遍的物理誘變方法是紫外誘變，也有一些是射線誘變，還有一些是微波輻射誘變等。

3.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學(xué)效應(yīng)，如引起染色體斷裂等，常用于處理遲發(fā)突變，并對(duì)某特定的基因或核酸有選擇性作用?；瘜W(xué)誘變劑主要有烷化劑，常用的有甲基磺酸乙酯（EMS）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等；核酸堿基類似物，常用的有5溴尿嘧啶（BU）、5溴去氧尿核苷（BudR）等；抗生素，如重氮絲氨酸、絲裂毒素C等，具有破壞DNA和核酸的能力，造成染色體斷裂。

Chand等[42]用溴乙錠和亞硝基胍復(fù)合誘變，在含有兩性霉素B濃度為2 μg /ml 的平板上選育出木霉屬抗性突變株CMV5A10，其FPA酶活、CMC酶活分別是野生菌的2.2 和2.1倍。李西波等[43]用青霉（Penicillium sp.）HK2003為原始菌，經(jīng)亞硝基胍（NTG）、羥胺復(fù)合誘變，篩選出一株高產(chǎn)、穩(wěn)定的纖維素酶菌株LX2435，其產(chǎn)酶能力由200 U/ml 提高到415 U/ ml，比出發(fā)菌株提高2 108倍。對(duì)該菌種進(jìn)行了連續(xù)8次繼代培養(yǎng)，結(jié)果表明其遺傳性狀穩(wěn)定。

關(guān)于單獨(dú)的化學(xué)誘變產(chǎn)酶菌株鮮有報(bào)道，多數(shù)是物理化學(xué)復(fù)合誘變。這是因?yàn)閺?fù)合誘變可達(dá)到更理想的效果。化學(xué)誘變所需的試劑一般為劇毒的誘變劑，其作用效果較明顯。尋找到適宜的誘變濃度、條件，能達(dá)到較理想的誘變種，但其誘變具有突變性和隨機(jī)性，也需要不斷嘗試尋找適宜的條件，一般所用誘變劑較多的是亞硝基胍（NTG），也可以是多種化學(xué)誘變及復(fù)合誘變，效果會(huì)更明顯。

3.3 物理化學(xué)復(fù)合誘變

物化復(fù)合誘變的研究有很多，將兩者結(jié)合可達(dá)到理想的產(chǎn)酶效果。大量的研究已經(jīng)證實(shí)這一點(diǎn)。Adsul等[44]研究表明，Penicillium janthinellum NCIM1171經(jīng)硫酸二乙酯處理24 h，然后紫外線處理3 min能得到產(chǎn)酶提高和透明圈明顯的菌株，可在含0.2% 2脫氧D葡萄糖的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，最后轉(zhuǎn)到含1.5% 的2脫氧D葡萄糖的培養(yǎng)基有5個(gè)突變體。林建國(guó)等[45]利用紫外、硫酸二乙酯和亞硝基胍3種誘變方法對(duì)發(fā)菌株Trichoderma viride進(jìn)行誘變育種，得到一突變菌株，其產(chǎn)酶能力最高值為437 U/（g·min），是出發(fā)菌株的2.03倍。董志揚(yáng)等[23]通過(guò)γ射線照射和亞硝基胍交替處理，誘變出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株T801，與出發(fā)菌株相比，其產(chǎn)酶能力提高1.77倍。蘭時(shí)樂(lè)等[46]以纖維素酶產(chǎn)生菌TP1202為出發(fā)菌株，通過(guò)微波誘變和硫酸二乙酯、氯化鋰誘變劑誘變，選育到1株纖維素酶高產(chǎn)菌株A。在適宜條件下，其產(chǎn)生的CMC、FPA和棉花糖酶活力分別是出發(fā)菌株的107.0%、152.4%和140.5%。管斌等[47]通過(guò)利用紫外線、亞硝基胍等對(duì)T.reesei進(jìn)行誘變處理，采用低劑量、反復(fù)多次復(fù)合誘變處理方法，用以2脫氧葡萄糖為降解產(chǎn)物阻遏物的高效篩選方法，選育得到一株抗分解代謝阻遏的突變株，使得纖維素酶活力提高3倍。武秀琴等[48]以黑曲霉得為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線（15 W，照射距離30 cm左右，照射時(shí)間8 min）、亞硝酸（0.1 mol/L的NaNO3，處理5 min）的復(fù)合誘變，復(fù)篩得到纖維素高產(chǎn)菌株，纖維素酶、濾紙酶活力分別提高了61.10%、64.01%。Jiang等[49]從來(lái)自新加坡的土壤樣品中分離出一種新的T.viride菌株，其突變體是經(jīng)過(guò)甲磺酸乙酯（EMS）處理結(jié)合紫外線照射得到的，發(fā)現(xiàn)突變體培養(yǎng)液可溶性蛋白含量、FPA酶的活性、β葡萄糖苷酶活性和CMC酶活性分別比野生菌株提高了1.67、2.49、2.16和2.61倍。Li等[50]對(duì)T.viride進(jìn)行微波和紫外線的聯(lián)合誘變?cè)囼?yàn)之后，選擇了7個(gè)誘變菌株（MB1～MB7），并且測(cè)定它們的CMC酶活。其中的5個(gè)（MB1、MB2、MB3、MB5和MB7）顯然有著更強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，要強(qiáng)于正常的野生型酶。它們產(chǎn)酶的性狀很穩(wěn)定，并在長(zhǎng)達(dá)9代內(nèi)生產(chǎn)纖維素酶。分子生物學(xué)研究表明，突變體MB1、B2、MB3和MB5發(fā)生內(nèi)切葡聚糖酶的堿基突變，但是MB7沒(méi)有發(fā)生改變。這表明堿基突變引起的內(nèi)切葡聚糖酶的氨基突變可能會(huì)導(dǎo)致纖維素酶產(chǎn)量的提高。

在尋找一個(gè)高效降解纖維素的酶生產(chǎn)者的過(guò)程中，F(xiàn)ang等[51]利用紫外光照射誘變和N甲基N′硝基氮亞硝基胍（NTG）進(jìn)行突變，得到枝頂孢屬纖維素降解菌C1，還分離到菌株CF2612。菌株CF2612表現(xiàn)出更高的FPA（17.8 U/ml），要高于親本菌株C1（12.3 U /ml）。CF2612的可溶性蛋白的產(chǎn)量和β葡糖苷酶活性也有顯著提高。Vu等[52]從320個(gè)鑒定為曲霉的菌株中篩選纖維素酶生產(chǎn)菌株，進(jìn)一步的改善方法是通過(guò)反復(fù)多輪鈷60γ射線輻照、紫外線處理和用N甲基N′硝基N亞硝基胍處理。最好的突變菌株是曲霉突變株XTG4，CMC酶活、濾紙纖維素酶活和β葡萄糖苷酶的纖維素酶活分別比野生菌株提高2.03、3.20、1.80倍。傳代培養(yǎng)19次后，曲霉屬的突變體 XTG4S仍穩(wěn)定。

物理和化學(xué)復(fù)合誘變已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用。一般，利用較常規(guī)的射線照射和化學(xué)試劑處理，選擇好適宜的誘變時(shí)間、劑量，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)可以獲得所需的高產(chǎn)菌種，誘變后菌株的產(chǎn)酶能力對(duì)照原始出發(fā)菌株有所提高。近年來(lái)，通過(guò)誘變方法選育新品種，再利用基因工程法對(duì)其機(jī)理進(jìn)行研究已成為一種選育新高產(chǎn)菌種的趨勢(shì)，有待更多的科研人員研究發(fā)現(xiàn)。

3.4 基因工程法

基因工程技術(shù)是提高纖維素酶活的一種高效、便捷的方法。通過(guò)改變菌體結(jié)構(gòu)，迅速、直接地改造菌體。Wang等[53]通過(guò)與碳代謝阻遏相關(guān)的RNA干擾技術(shù)來(lái)提高康氏木霉菌種產(chǎn)酶，主要是使與產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶相關(guān)的代謝產(chǎn)物阻遏調(diào)控基因沉默。結(jié)果表明，RNA干擾后的菌株在濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活方面分別提高2.1、1.4、0.8和0.8倍?？梢?jiàn)，RNA干擾利用在分析基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和提高纖維素酶活方面是可行的。Ma等[54]通過(guò)對(duì)斜臥青霉中β葡萄糖苷酶基因的異源表達(dá)來(lái)提高里氏木霉（Trichoderma reesei）的纖維素酶活。該研究將斜臥青霉β葡萄糖苷酶I的編碼序列與T.reesei的纖維二糖水解酶I（cbh1）啟動(dòng)子進(jìn)行連接，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入里氏木霉Rut30的基因組。與親代菌株相比，2個(gè)篩選的轉(zhuǎn)化菌株中的β葡萄糖苷酶活增加了6～8倍，同時(shí)它們的FPA平均增加了30%。Salazar等[55]為了獲取高效的纖維素酶，采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法，建立白腐真菌（WRF）文庫(kù)，從中克隆獲得Polysticus versicolor編碼內(nèi)切葡聚糖酶的一個(gè)基因和Agrocybe aegerita編碼纖維二糖纖維二糖水解酶一個(gè)基因，將這些基因在原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些新酶具有纖維素酶特性。建立白腐真菌（WRF）文庫(kù)也是一個(gè)產(chǎn)纖維素酶有前景的方法。

已有研究表明，通過(guò)調(diào)節(jié)纖維素酶產(chǎn)生菌的調(diào)控因子可以在不同程度改變酶的產(chǎn)生量。Coradetti等[56]以模式絲狀真菌Neurospora crassa為研究對(duì)象，篩選與纖維素降解相關(guān)的非特異性轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子 clr1和clr2。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，CLR1和CLR2在多數(shù)降解纖維素的絲狀真菌中存在且保守。CLR1對(duì)于clr2的表達(dá)和纖維二糖的利用是必需的。缺失clr2的Aspergillus nidulans菌株不能誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)，且缺乏木聚糖酶活力。為提高T.reesei的纖維素降解能力，Rahman等[57]將egl3和xyn3與β葡萄糖苷酶I編碼區(qū)進(jìn)行同源重組，重組菌株的β葡萄糖苷酶I的活力分別比出發(fā)菌株提高4.0、7.5倍。由此可知，通過(guò)對(duì)產(chǎn)酶菌種的纖維素酶基因進(jìn)行啟動(dòng)子的調(diào)控，也可以有效地提高纖維素酶的表達(dá)量。 陳科等[58]研究了Erwinia chrysanthemi的纖維素酶基因。為提高纖維素酶celY基因在原核細(xì)胞中的分泌表達(dá)量，分別構(gòu)建由脂蛋白啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、果膠酶信號(hào)肽調(diào)控的多種表達(dá)載體。與由纖維素酶celY基因自身的啟動(dòng)子和信號(hào)肽調(diào)控的表達(dá)載體相比，發(fā)現(xiàn)由脂蛋白啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、果膠酶信號(hào)肽調(diào)控的表達(dá)載體都在不同程度提高celY基因的分泌表達(dá)量。

基因組改組（Genome shuffling）是微生物育種學(xué)中的一項(xiàng)新興技術(shù)。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可在微生物遺傳背景未知的條件下改變遺傳性狀[59]。它已被視為是一種快速提高細(xì)胞表型的新型基因工程方法，不僅用于改良菌種，而且用于提供復(fù)雜的表型信息[60]。目前，這項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用到提高纖維素酶生產(chǎn)菌產(chǎn)酶能力的研究中，并初見(jiàn)成效。Cheng[61]在研究 Penicillium decumbens JUA10菌種產(chǎn)酶時(shí)，經(jīng)過(guò)2輪基因組改組，獲得3個(gè)融合子GS215、GS221和GS222，相比于初始菌株，融合子菌株的FPA分別提高100%、109%和94%。當(dāng)以玉米芯為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，培養(yǎng)44 h后相比于初始菌株FPA增長(zhǎng)117%、142%和118%，結(jié)果證實(shí)通過(guò)基因組改組的方法可以使得菌株更早的大量產(chǎn)酶。Xu等[62] 利用基因組改組技術(shù)來(lái)增強(qiáng)T.viride產(chǎn)纖維素酶的能力，通過(guò)紫外（UV）照射、低能離子注入和常壓非平衡放電等離子體（APNEDP）方法得到初始突變?nèi)后w。突變?nèi)后w進(jìn)行反復(fù)原生質(zhì)體融合后，獲得菌株T.viride F161，其在秸稈中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后纖維素酶活是原始出發(fā)菌株的1.97倍。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)纖維素酶，運(yùn)用基因工程技術(shù)在分子水平上對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行分子改造，有望解決一些纖維素酶活性（熱穩(wěn)定性、pH、阻遏性等）低的應(yīng)用缺陷。但是，通過(guò)基因工程方法構(gòu)建的菌種多數(shù)存在著基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的缺陷，且目前大部分纖維素酶基因的表達(dá)水平還較低，纖維素酶基因工程的主要難題是如何實(shí)現(xiàn)不同組分的有效表達(dá)和提高表達(dá)量。這些都需要進(jìn)一步的攻關(guān)。無(wú)論如何纖維素酶的基因工程研究，目前已得到足夠的重視，并且有望在纖維素酶生產(chǎn)上起到革命性的作用[59]。

4 結(jié)語(yǔ)

纖維素酶作為一種高分子復(fù)合酶，具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)且不易分離、純化的特點(diǎn)。纖維素酶的生產(chǎn)歷史較短、規(guī)模較小、酶活力也較低，生產(chǎn)工藝需要進(jìn)一步研究和完善。選擇優(yōu)良的菌種是提高纖維素酶活力的關(guān)鍵，但還需要有適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)方法和培養(yǎng)條件才能充分發(fā)揮優(yōu)良菌種的性能，得到較高的酶產(chǎn)量。早在20世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)外就對(duì)纖維素酶進(jìn)行相關(guān)的研究。研究表明，大部分的纖維素酶是由細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生的。里氏木霉T.reesei（Hypocrea jecoriha）是迄今為止研究的最為清楚的[63]，并且通過(guò)菌種改造、發(fā)酵工藝的改進(jìn)，T.reesei生產(chǎn)纖維素酶的能力得到很大的提高。

目前，人們對(duì)真菌和細(xì)菌的纖維素酶研究較多，而對(duì)放線菌纖維素酶的研究很少，并且纖維素酶的產(chǎn)量和活性都偏低。今后，應(yīng)加強(qiáng)菌種選育和發(fā)酵工藝等基礎(chǔ)研究工作，分離和篩選出高效纖維素分解菌群，并且用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步優(yōu)化菌種，提高酶活。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)提高纖維素酶活性的方法都在逐漸探索階段，主要集中在微生物分離、選育、產(chǎn)酶條件優(yōu)化以及一些已知纖維素酶基因的克隆和異源表達(dá)，雖在培養(yǎng)條件優(yōu)化和菌種分子改造方面初有成效，但沒(méi)有一種方法能快速提高酶產(chǎn)量，大幅提高酶活性。

纖維素酶的廣泛應(yīng)用對(duì)解決食品短缺、緩解能源危機(jī)、減少環(huán)境污染、加快工業(yè)進(jìn)程等方面有重要的現(xiàn)實(shí)意義。如何篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株、提高現(xiàn)有菌種的產(chǎn)酶能力，需要科研工作者們進(jìn)一步的研究。摸索適合不同菌種的產(chǎn)酶工藝、保持酶活的穩(wěn)定性是進(jìn)一步研究的主要內(nèi)容。通過(guò)不斷的努力攻關(guān)，纖維素酶的成本會(huì)不斷降低，直至實(shí)現(xiàn)生物燃料的工業(yè)化生產(chǎn)。

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