張照然　禹虹霞　馬彥嬌等

摘要 [目的]對引起三七細菌性葉斑病的病原菌進行系統(tǒng)鑒定。[方法]以2011及2012年在云南文山及石林縣的三七苗圃采集的三七細菌性葉斑病病株為材料，采用柯赫氏法則，檢測分離菌株致病性并重新分離得到病原菌。通過病菌形態(tài)觀察、致病性測定、16S rDNA序列分析及生理生化特性分析（Biolog系統(tǒng)）對其進行鑒定。[結(jié)果]確定三七細菌性葉斑病病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae）。[結(jié)論]該研究為三七細菌性葉斑病菌詳細鑒定的國內(nèi)首報。

關鍵詞 三七細菌性葉斑病；丁香假單胞菌；病原菌鑒定

中圖分類號 S435.67 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01351-02

Abstract [Objective] To identify bacterial leaf spot disease caused by Pseudomonas syringae pv. syningae on Panax notoginsng. [Method] The tested materials were collected from Wenshan and Shilin County in Yunnan Province in 2011 and 2012， using Kochs rule， through morphology observation， pathogenicity test， 16S rDNA sequence analysis and biochemical and physiological characters， the identification was conducted. [Result] The pathogen was identified as Pseudomonas syringae pv. syringae according to the characters of cultural colonies， morphological observation， 16S rDNA sequences analysis and biochemical and physiological identification （Biolog carbon source utilization analysis）. [Conclusion] This was the first report of Pseudomonas syringae pv. syringae caused bacterial leaf spot of Panax notoginsng in China.

Key words Panax notoginsng； Pseudomonas syringae pv. syringae； Pathogens identification

三七（Panax notoginsng （Burk）F.H Chen）是我國的名貴中藥材，主產(chǎn)地為云南省文山縣，但長達3年的生長周期，使三七遭受了各類病蟲害的侵染。目前文山三七主產(chǎn)區(qū)主要病害有軟腐病、圓斑病、細菌性青枯病、疫霉病、灰霉病[1-2]、根結(jié)線蟲病[3]等。2011年8月及2012年7月，筆者先后在云南省文山縣和石林縣的三七種植片區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新的葉片病害——三七細菌性葉斑病暴發(fā)，且影響程度越來越嚴重，大有蔓延流行的趨勢。這種病害在初期雖然只引起葉斑癥狀，但后期可引起葉片局部枯萎壞死和整株死亡。目前國內(nèi)并無關于三七細菌性葉斑病詳細鑒定的相關研究。為此，筆者從形態(tài)鑒定、致病性測定、16S rDNA序列分析及生理生化特性分析對引起三七細菌性葉斑病的病原菌進行了系統(tǒng)鑒定，以期為提高三七的品質(zhì)、產(chǎn)量及病害防治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為SQYB12（云南文山）和SQYB13（云南石林）；供試三七植株采自云南省文山縣和石林縣的三七種植區(qū)；供試培養(yǎng)基、試劑及儀器參照周麗洪等人研究[4]。

1.2 方法

1.2.1

標樣采集。2011年8月與2012年7月分別從云南省文山縣和石林縣的三七種植基地采集具典型細菌性葉斑病癥狀的三七標本。

1.2.2

分離培養(yǎng)及形態(tài)鑒定。

采用平板劃線分離，具體操作參照王敏等人研究[5]。純化保存方法參照白學慧等人研究[6]。兩次分離共獲得8株細菌菌株，編號分別為SQYB11、SQYB12、SQYB13、SQYB14、SQYB15、SQYB16、SQYB17、SQYB18。該試驗采用的菌株為SQYB12及SQYB13。病原菌形態(tài)鑒定方法參照王永吉等人研究[7]。

1.2.3

致病性測定。致病性測定采用噴霧接種法接種，具體步驟參照姬廣海等人研究[8]。對照三七噴霧接種無菌水。待癥狀出現(xiàn)后，采集病斑重新分離。

1.2.4

生理生化鑒定。

生理生化測定試驗采用Biolog公司的MicrostationTM V4.01系統(tǒng)和革蘭氏陰性菌微孔板（GN）來鑒定，具體鑒定方法參照吳亞鵬等的報道[9-11]。

1.2.5

16S rDNA序列同源性分析。細菌的基因組DNA提取采取細菌快速微量提取法進行[12]，然后利用瓊脂糖電泳檢測提取DNA濃度和純度。16S rDNA的通用引物27F/1492R對SQYB12和SQYB13進行PCR擴增。PCR擴增體系及程序參照劉娜等人研究[13]。PCR擴增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測擴增后的目的條帶。用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，對SQYB12和SQYB13的PCR產(chǎn)物進行純化克?。ㄔ噭┖匈徸陨虾Ｉど锕こ坦煞萦邢薰?，純化克隆步驟均參照試劑盒）。將克隆后的大腸桿菌菌液送去測序公司測序。測序后將目的片段剪切下來，然后同時采用GenBank Blast以及DNAMAN進行序列同源性比較[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀觀察及致病性測定

健康三七噴霧接種SQYB12和SQYB13 15 d后，三七葉片有輕微的發(fā)病癥狀，開始出現(xiàn)淡綠色水漬小點。21 d后，葉片上的小斑點開始聚集成棕色不規(guī)則大病斑，病斑直徑3～10 mm，周圍出現(xiàn)黃色退綠暈圈。30 d后，不規(guī)則大片病斑逐漸變褐，形成枯斑（圖1）。40 d 后三七葉片開始失水萎蔫，甚至枯萎落葉。對照三七植物上始終未觀測到發(fā)病癥狀。

經(jīng)觀察，噴霧接種后各時期發(fā)病癥狀均與三七細菌性葉斑病自然發(fā)病癥狀相似。葉斑初期常見于葉緣，常引起葉片退綠并形成褐色病斑。濕度高時，發(fā)病情況加重且侵染速度加速。發(fā)病后再分離出的3株菌株分別命名為SQYB21、SQYB22、SQYB23。

3 結(jié)論與討論

綜合病害癥狀觀察和病菌分離、病菌形態(tài)觀察、病菌Biolog生理生化測定、16S rDNA序列分析等鑒定方法，可將引起三七細菌性葉斑病病原菌鑒定為丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae）[17-19]。該病害癥狀為發(fā)病初期葉片邊緣出現(xiàn)不規(guī)則病斑，病斑周圍有退綠黃色暈圈，發(fā)病嚴重時可引起全株枯萎。高溫高濕環(huán)境下，病害擴展迅速，可在短期內(nèi)造成三七成片死亡。

從Biolog微生物鑒定系統(tǒng)顯示結(jié)果，以明確試驗菌株與數(shù)據(jù)庫中標準菌株對各類碳氮源利用率的差異。標準菌株部分利用，但試驗菌株可完全利用的碳源有乳果糖（B9）、D甘露醇（B11）；試驗菌株部分利用，但標準菌株可完全利用的碳源有α-酮戊二酸（E4）、γ-氨基丁酸（G12）；試驗菌株可部分利用，但標準菌株不能利用的碳源有L-亮氨酸（G3）、龍膽二糖（B5）。雖然了解了試驗菌株與標準菌株對各類碳氮源利用率的差異，

但是造成這種差異的原因目前還不明確，筆者猜測是由于細菌的進化和分化所造成的。另外，筆者將收集多個地區(qū)的三七細菌性葉斑病病原菌，對其致病力、生化型及致病型[20]進行研究，以了解病菌的多樣性，同時利用repPCR分子指紋技術(shù)[21] 對病菌遺傳多樣性進行分析。目前三七葉斑病菌的拮抗細菌菌株的篩選[19]試驗工作已經(jīng)開展，期望能達到預防和控制三七細菌性葉斑病利于三七產(chǎn)業(yè)的效果。

參考文獻

[1]王勇，范昌，陳昱君，等.三七的主要病害及防治現(xiàn)狀[J]. 人參研究，2003，15（1）：43-45.

[2] 劉云龍，陳昱君，何永宏.三七圓斑病的初步研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報，2002，17（3）：297-298.

[3] 楊佩文，崔秀明，董麗英，等.云南三七主產(chǎn)區(qū)根結(jié)線蟲病病原線蟲種類鑒定及分布[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2008，23（4）：479-482.

[4] 周麗洪， 王永吉，韓陽，等.麗格海棠細菌性葉斑病病原菌鑒定[J]. 西南師范大學學報：自然科學版，2012，37（12）： 56-61.

[5] 王敏，姬廣海，修建華，等.云南省馬蹄蓮細菌性軟腐病病原鑒定[J].西南大學學報：自然科學版，2007，29（8）：79-82.

[6] 白學慧，周麗洪，胡永亮，等.咖啡細菌性葉斑病病原的分離與鑒定[J].熱帶作物學報，2013，34（4）： 738-742.

[7] 王永吉，張麗輝，魏蘭芳，等.生防細菌C3的鑒定及對魔芋軟腐病的防效研究[J].西南大學學報：自然科學版，2012， 34（2）： 17-22.

[8] 姬廣海，方敦煌，殷端，等.香料煙細菌性斑點病病原鑒定[J].植物病理學報，2007，37（3）： 232-236.

[9] 吳亞鵬，姬廣海，陳云蘭，等.生防細菌131對魔芋軟腐病的控制及機理研究[J].中國生物防治，2010，26（2）：193-196.

[10] 張朝正，郭蘭珍. 利用16 SrDNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產(chǎn)脂肪酶菌株[J]. 河北工業(yè)大學學報，2009，38（5）：52-55.

[11] 孔濱，楊秀娟. Biolog 生態(tài)板的應用原理及碳源構(gòu)成[J]. 綠色科技，2011（7）：231-234.

[12] 劉以祥，李柏林，歐杰，等. 野油菜黃單胞菌基因組DNA快速提取方法和酶切[J]. 食品科學，2004，25（11）：237-240.

[13] 劉娜，王琨. 生姜中抗黑曲霉活性內(nèi)生細菌的篩選與鑒定[J]. 中國農(nóng)學通報，2013，29（4）：57-61.

[14] DENNIS B，DAVID L. GenBank：update[J]. Nucleic Acids Research，2004，32：23-26.

[15] 肖亦農(nóng)，崔藝久，徐瓊，等.一種新沼澤紅假單胞菌鑒定及其類胡蘿卜素含量分析[J]. 科技導報，2013，31（13）： 58-62.

[16] KOICHIRO T. MEGA5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[17] 劉鵬，魏亞東，崔鐵軍. Biolog系統(tǒng)和16S rDNA序列分析方法在植物病原細菌鑒定中的應用[J]. 植物檢疫，2006，20（2）：86-87.

[18] 程池，楊梅，李金霞，等. Biolog微生物自動分析系統(tǒng)——細菌鑒定操作規(guī)程的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（5）：50-54.

[19] 張伏軍，林立鵬，唐婧，等.一株煙草青枯菌拮抗細菌的篩選及鑒定[J]. 西南大學學報：自然科學版，2007，29（9）： 91-94.

[20] 王敏，劉勇，李梅云，等.云南省煙草上青枯雷爾氏菌的致病力、生化型和致病型研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2009，22（3）： 636-640.

[21] 劉雅婷，李永忠，張世珖，等. 云南煙草野火病菌遺傳多樣性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學學報，2001，23（6）： 514-517.